不同贮藏温度下印度块菌净菜品质变化及其货架期研究

清 源,方志荣,姚 昕,尹 胜

(1.西昌学院 攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室,四川 西昌 615013; 2.会东高川天源农业科技有限公司,四川 会东615200)

块菌(truffle)又称为松露、猪拱菌、无娘果、土茯苓等,享有“厨房里的黑钻石”和“上帝的食物”之美誉,是一类与树木共生的地下真菌。在生物学分类上隶属于真菌界(Eumycetes)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、块菌目(Tuberales)、块菌科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)[1]。研究显示,块菌子实体中含有丰富的蛋白质、氨基酸、碳水化合物、麦角固醇、甾醇等营养物质和芳香成分,并具有抗氧化、抗微生物和抗诱变等药用价值[2-3]。由于资源稀缺,食药用价值高,块菌已是当今世界食用菌市场上价格最昂贵的菌类之一,在国际国内市场上供不应求[4]。在我国,西南地区的四川省和云南省是印度块菌(T.indicum)的主要产区,每年10—12月份的子实体达到成熟并可采收。由于采后的印度块菌子实体仍具有生理后熟作用,加上表面没有明显的保护结构,容易失水和受到微生物的侵染,出现变软、变黏和发臭等现象,给产业发展带来较大的经济损失。因此,生产上迫切需要适宜的贮、运、销及保鲜技术,以满足日益增长的生鲜商超运营要求。尤其是,新鲜采挖的块菌表面附着大量泥沙,经过挑选、修整、清洗和包装等处理后,可直接烹食或生食,符合当下消费者快节奏、高效率的生活需求。但是,国内针对印度块菌净菜品质变化及控制技术的系统研究却相对较少[5-6]。

通常控制贮藏温度是延长果蔬货架期的关键。适宜的温度可以降低果蔬的生理代谢水平和呼吸作用,抑制酶活性和微生物的生长,以保持其良好的商品性状。但是,贮藏温度过低易导致果蔬产生冷害或冻害,从而影响其耐贮性和抗病性[7]。因此,继冷藏、冻藏之后的近冰温贮藏技术被广泛应用,可最大程度地减少低温对果蔬内部组织和细胞的破坏,降低能耗。目前该技术在苹果、梨、火龙果、枣、西兰花等果蔬已有相关研究[8-9],但尚未见在印度块菌净菜方面的报道。

本文以国产印度块菌为研究对象,在测定冰点温度的基础上,将其加工包装为净菜并放置在近冰温、(0±1)、(4±1)、(8±1)、(12±1)和(16±1) ℃条件下贮藏,分析失重率、腐败率、呼吸强度、可溶性蛋白含量、PPO活性、菌落总数、硬度和感官评价等的变化,通过Pearson 相关系数分析,筛选最佳指标构建货架期预测模型。采用经典的Arrhenius 方程结合零级或一级动力学模型建立块菌净菜贮藏品质劣变动力学模型及货架期预测模型,以期为块菌净菜生产、贮藏及销售过程中的品质变化、监控和评价体系的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜印度块菌样品购自凉山州会东县。挑选成熟度一致、无机械损伤、无病虫害、大小基本一致的块菌运回实验室进行处理。

考马斯亮蓝G-250粉末、95%乙醇、85%磷酸、氯化钠、冰醋酸、无水醋酸钠、聚乙二醇(PEG)6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、Triton X-100、无水醋酸钠、邻苯二酚、愈创木酚等为分析纯,平板计数琼脂PCA为生物试剂,标准牛血清白蛋白(≥98%)等均由西昌迪安实业公司提供。

1.2 仪器与设备

Tu1810 紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;ME203TE 电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SHB-B95 真空抽滤机,上海振捷实验设备有限公司;培养箱,湖北恒丰医疗制药设备有限公司;SW-CJ-1F双人台式超净工作台,浙江力辰科技有限责任公司;TA. XT Plus 型质构仪,英国 SMS 公司;TGL-1850 高速微量冷冻离心机,四川蜀科仪器有限公司;L93-1一路温度记录仪,杭州路格科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冰点温度的测定

取成熟度>80%(成熟)且大小均匀的新鲜块菌,随机分组后,将温度记录仪的探头垂直插入块菌子实体中心,然后放入-18 ℃冰箱中,每隔 20 s自动记录一次菌体中心温度,待菌体完全冻结后,将数据导入计算机中,绘制温度变化曲线以确定冰点温度。其中,成熟度测定参考唐平等[10]的方法,随机抽取10个块菌在显微镜下检测其子囊孢子颜色变化情况,颜色为棕色的属成熟。

1.3.2 样品处理

将新鲜块菌用清水洗去表面泥沙,再以无菌蒸馏水淋洗后晾干,采用市售聚乙烯(PE)包装袋(厚度0.006 mm)进行包装,装袋量为(500±10) g,每个温度12袋样品,然后放置于近冰温、(0±1)、(4±1)、(8±1)、(12±1)和(16±1) ℃,相对湿度70%～80%的条件下贮藏,每隔4 d取样测定相关指标。每个温度设置3次重复。

1.3.3 测定指标与方法

失重率:采用称重法统计失重率[11]。失重率(%)=(贮前质量-贮后质量)/贮前质量×100。

腐败率:采用计数法,根据块菌表面可见的长霉、流水、软化、发黏和异味等综合考虑是否腐败[12]。结果以测定时已发生腐烂的块菌个数占总个数的百分比表示。腐败率(%)=腐烂个数/总测定个数×100。

硬度:采用TA.XT Plus型质构仪测定,探头为 P/5(直径5 mm),触发力为5 g,前速率为1 mm·s-1,测试速率为0.5 mm·s-1,测试后速率为2 mm·s-1,深度为10 mm。随机选取10个块菌样品进行测试,去除较大差异的个别样品后取其平均值。

呼吸强度:采用GXH-3010E 型便携式红外线 CO2分析仪测定[13]。称取 50 g块菌样品,置于1 L 锥形瓶中并密封,室温下贮藏20 min,使用CO2分析仪测定呼吸强度。每个温度组分别测定 3 次,求平均值。以每千克块菌样品每小时释放的 CO2质量表示,即 mg·kg-1·h-1。

可溶性蛋白含量:采用考马斯亮蓝法测定[14]。称取10 g块菌样品,加入 50 mL蒸馏水研磨匀浆后,低温离心20 min,收集上清液为可溶性蛋白提取液。显色反应体系:0.7 mL 样品液,再加入0.3 mL 蒸馏水,5 mL考马斯亮蓝G-250溶液,混匀放置2 min,595 nm 波长处测定吸光值。以牛血清白蛋白为标准品,制作的标准曲线方程为:Y=0.002 8X+0.009 3,R2=0.9924。

PPO活性:参照曹建康等[15]的方法测定。称取5 g块菌样品,加入 5 mL 0.1 mol·L-1、pH 5.5的乙酸-乙酸钠提取缓冲液(含1 mmol·L-1PEG、4% PVPP、1% Triton X-100 ),在冰浴的条件下研磨成匀浆,4℃ 12 000×g条件下离心 30 min,收集上清液即为酶液,低温下保存备用。反应体系为4 mL 50 mmol·L-1、pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液、1 mL 50 mmol·L-1邻苯二酚溶液、100 μL酶液,420 nm波长处每隔1 min中测定吸光值。以每克块菌样品每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位,单位为ΔD420·min-1·g-1。计算公式:

U=ΔD420·V/Vs·m。

其中,V是样品提取液总体积,mL;Vs是测定时所取样品提取液体积,mL;m是样品质量,g。

菌落总数:参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物检验 菌落总数测定》进行测定,采用系列稀释和平板计数法进行计数。

1.3.4 感官评定

由受过专业培训的10名食品专业人士,通过手压块菌、鼻闻气味、眼观颜色和纹理等,综合评价可接受程度。感官评价采用10分制,具体标准参考黎琦等[6]的方法稍作修改后制定,详见表1。各项分数越高,表示品质越好。

1.3.5 块菌净菜贮藏期间货架期模型预测

通过 Pearson 相关系数分析确定贮藏块菌的关键指标,分别利用零级动力学方程式(1)和一级动力学方程式(2)进行回归方程拟合。再根据回归方程的系数R2确定适合的动力学方程模型:

A=A0±kt;

(1)

A=A0ekt。

(2)

式中:A,t时刻块菌的某项指标测定值;k,块菌的某项指标测变化速率常数;A0,块菌的某项指标初始测定值;t为块菌贮藏时间。

将变化速率常数k代入 Arrhenius 公式(3),再用 1/T 和 lnk作为横纵坐标作图,预测块菌净菜的货架期。

lnk=lnk0-Ea/RT。

(3)

其中,k0为方程指前因子,mg/(g·d);Ea为活化能,kJ·mol-1;R为气体常数,8.314 J·mol-1·K-1;T为绝对温度。

1.4 数据分析

平均数以及标准方差通过Excel 2020进行整理分析,经过SPSS 17.0 进行数据分析(采用Duncan 法分析差异显著性,P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 块菌冰点温度

如图1所示,块菌子实体的中心温度随着贮藏时间的延长呈线性下降趋势,当块菌子实体降低到一定的低温(过冷点)出现过冷现象,随后会有一段小幅度迅速回升的过程,主要由子实体内部潜热释放所引起,并在一段时间内温度不发生变化,此温度即-4.45 ℃为块菌的生物结冰点。此后子实体又开始冻结,温度缓慢下降。为避免因贮藏温度不稳定所造成的子实体冻害现象,本研究中选择(-3±1) ℃为块菌最低贮藏温度。

图1 块菌冰点曲线

2.2 失重率

块菌采后子实体容易蒸腾失水,从而导致质量损失和品质下降,影响其耐贮性和抗病性,最终失去商品价值。因此,失重率是评价块菌保鲜的重要指标之一[16]。由图2可知,在不同贮藏温度条件下,随着时间的延长,块菌的失重率均呈上升趋势,且贮藏温度越高,失重率越大。其中,(16±1)℃组的失重率变化最快,高于其他温度组,且贮藏至30 d时与(12±1) ℃组无显著差异,与其他温度组差异显著(P<0.05)。贮藏前10 d,(-3±1)和(0±1) ℃、(4±1)和(8±1) ℃、(12±1)和(16±1) ℃组之间无显著差异。贮藏至15 d时,(-3±1)和(0±1) ℃组之间无显著差异,与其他组差异显著(P<0.05)。贮藏至20 d 后,(-3±1) ℃条件下的块菌失重率出现快速增大的现象,此时菌体出现组织松软、内部花纹消失和颜色发黑等现象。贮藏至30 d 时,(0±1)℃组的块菌失重率最小为3.25%,(-3±1)℃组次之为6.71%;(16±1) ℃组失重率最大为12.75%,但与(12±1) ℃组无显著差异。由此可见,低温可有效缓解块菌失重率的增加,这可能与贮藏温度降低,导致块菌的蒸腾作用和呼吸作用减弱有关[17]。

同一贮藏时间不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 腐败率

腐败率是判断果蔬保鲜效果的重要指标,也是评价其贮藏性能最明显的指标之一[18]。块菌净菜在贮藏过程中的腐烂变质主要表现为子实体变软、发霉、表面黏液和有刺激性臭味等,导致营养和商业价值下降。如图3所示,在不同贮藏温度条件下,块菌的腐败率随时间的延长均呈上升趋势,且贮藏温度越高,腐败率越大。贮藏至25 d时,(16±1) ℃组的块菌腐败现象最为严重,腐败率高达57.51%,基本失去商品价值;而(-3±1)和(0±1) ℃组的腐烂率较小,均低于10%。但是,随着贮藏时间的延长,(-3±1) ℃组块菌逐渐发生类似冷害的现象,导致子实体软烂,商品价值降低。贮藏至30 d时,(0±1)、(-3±1)、(4±1)和(8±1) ℃组的腐败率无显著差异,而(0±1) ℃组的腐败率最小仅为7.69%,表现较好。

图3 贮藏温度和时间对块菌净菜腐败率的影响

2.4 硬度

硬度可以客观地反映食用菌的成熟程度和品质状态[19]。由图4可知,在贮藏期间,(-3±1) ℃组的块菌净菜硬度随时间的延长呈逐渐下降趋势,这可能与低温贮藏过程中,较大的温度波动造成的冻害现象有关;而其余温度条件下的块菌则会出现 2 次显著的子实体硬度快速上升,这可能是因子实体失水所致。其中,(16±1) ℃组分别出现在10 d和20 d,其他温度组分别出现在15 d和25 d。贮藏至30 d时,(0±1) ℃组的硬度显著高于其他温度组(P<0.05),硬度变化幅度最小。因此,适当低温可以较好地抑制块菌失水,维持贮藏期间的硬度,延缓子实体硬度的快速变化。

图4 贮藏温度和时间对块菌净菜硬度的影响

2.5 呼吸强度

采后食用菌的呼吸作用与其子实体的生理衰老有关[20]。通常情况下,采后呼吸强度大,有机物消耗多,生理品质变化越明显,贮藏期和货架期会缩短[21]。但是,呼吸强度过低同样导致果蔬正常的新陈代谢被破坏,一定程度上也影响贮藏期[22]。从图5可以看出,除(-3±1) ℃组外,其余贮藏温度下的块菌采后呼吸强度呈跃变型,随着时间的延长呼吸强度呈现先上升后下降、再上升又下降的趋势。贮藏至5 d 时,各温度条件下的块菌均达到第一个呼吸高峰,其中(12±1)和(16±1) ℃组的块菌呼吸强度显著高于其他各组(P<0.05);(0±1) ℃组块菌的呼吸强度最低仅为初始呼吸强度的1.27倍。贮藏至 25 d时,各温度条件下的块菌达到第2个呼吸高峰,其中(-3±1)、(0±1)和(4±1) ℃组的呼吸强度始终维持在较低水平,与其他3个温度组呈显著性差异(P<0.05)。可见,低温能有效降低块菌净菜的呼吸强度。结合采后失重率和腐败率分析,(0±1) ℃条件下贮藏更有利于维持贮藏期间品质。

图5 贮藏温度和时间对块菌净菜呼吸强度的影响

2.6 可溶性蛋白含量

食用菌在采后贮藏过程中,可溶性蛋白被分解用以满足各种代谢需要[23]。由图6可知,不同温度贮藏下的块菌净菜,可溶性蛋白含量均呈下降趋势,且随着温度的增高降幅增大。贮藏至5 d时,各温度组间无显著差异。贮藏至30 d时,(8±1)、(12±1)和(16±1) ℃组的块菌可溶性蛋白含量下降较快,而(-3±1)、(0±1)和(4±1) ℃组的可溶性蛋白含量下降相对较慢,损失较少。可见低温贮藏能有效地抑制可溶性蛋白的降解,降低其损失。贮藏至30 d时,(-3±1)和(0±1) ℃组的可溶性蛋白含量差异不显著,与(4±1) ℃组差异显著(P<0.05)。

图6 贮藏温度和时间对块菌净菜可溶性蛋白含量的影响

2.7 PPO活性

PPO活性与食用菌褐变程度呈正相关性,在有氧条件下,PPO可以氧化酚类物质形成醌等褐色素,严重影响菌体的感官品质[24]。由图7可知,不同温度贮藏下的块菌净菜,其PPO活性随着贮藏时间的延长均呈增强趋势,且温度越高活性越强。贮藏至30 d时,(-3±1)和(0±1) ℃组的PPO活性分别为初始值的2.11和2.41倍;而(4±1)、(8±1)、(12±1)和(16±1) ℃组分别为初始值的3.43、4.14、4.67和4.86倍。由此可见,(-3±1)和(0±1) ℃组的PPO活性升高趋势明显低于其他温度组(P<0.05),且始终保持在相对较低水平,分别为12.17和13.83 U·g-1,但二者之间无显著差异。

图7 贮藏温度和时间对块菌净菜PPO活性的影响

2.8 菌落总数

微生物的生长与繁殖是导致块菌采后腐败变质的主要原因之一。通常,菌落总数是用来评价食品安全性和货架期的重要参考指标[25]。由图8可知,贮藏期间,不同温度下贮藏的块菌表面菌落总数均呈增加趋势。其中,(-3±1)、(0±1)和(4±1) ℃组增速较缓慢,且明显低于其他3个温度组(P<0.05)。贮藏至5 d时,(12±1)和(16±1) ℃组的菌落总数已达106lg(CFU·g-1)。参考陈慧芝[26]的研究,即食用蔬菜的菌落总数不应超过106lg(CFU·g-1),而完整蔬菜的菌落总数不应超过108lg(CFU·g-1),否则出现腐败现象。块菌经过清洗、包装等处理后,会导致其抵御微生物侵染的能力下降、组织和细胞结构受到一定破坏。因此,当菌落总数超过106lg(CFU·g-1)时,判断块菌净菜的新鲜度将开始下降。贮藏至10 d时,(8±1) ℃组的块菌菌落总数达到106lg(CFU·g-1);15 d时,(4±1)℃组的块菌菌落总数达到106lg(CFU·g-1);20 d时,(-3±1)和(0±1) ℃组的菌落总数才达到106lg(CFU·g-1)。贮藏至30 d时,(8±1)、(12±1)和(16±1) ℃组的菌落总数均高达107lg(CFU·g-1)以上,而(-3±1)、(0±1)和(4±1) ℃组的菌落总数分别为4.8×106、4.25×106和4.78×106lg(CFU·g-1),且差异不显著。由此说明,低温可以显著抑制块菌表面微生物的生长繁殖速度。

图8 贮藏温度和时间对块菌净菜菌落总数的影响

2.9 感官评分

从图9可以看出,在不同贮藏温度下,块菌净菜的感官评分随时间延长而下降,且贮藏温度越高,菌体腐烂变软、发霉发臭、色泽下降越快,评分降低越明显。贮藏至10 d时,(16±1) ℃组的块菌感官评分下降至13.16分,消费者可勉强接受其食用性;贮藏至15 d时,(12±1) ℃组的块菌感官评分下降至10.18分,消费者可勉强接受其食用性;贮藏至20 d时,(8±1)和(4±1) ℃组块菌感官评分分别下降至11.10和14.26分,消费者可勉强接受其食用性。贮藏至30 d时,仅有(-3±1)和(0±1) ℃组的块菌可被消费者接受,分别为13.38和12.32分且差异不显著。

图9 贮藏温度和时间对块菌净菜感官评分的影响

2.10 货架期预测模型的建立

2.10.1 Pearson相关系数分析

Pearson相关系数越大,说明品质指标之间的相关性越高[27]。块菌净菜贮藏期间各品质指标与其感官评分间的 Pearson 相关系数见表2。硬度与感官评分的相关性仅在(-3±1)和(12±1) ℃时呈极显著或显著正相关,呼吸强度与感官评分的相关性仅在(-3±1)和(0±1) ℃时呈极显著负相关。菌落总数与感官评分的相关性除在(16±1) ℃时不显著外,其余温度时均呈极显著负相关。不同贮藏温度下,失重率、腐败率、PPO活性与感官评分间呈极显著或显著负相关,可溶性蛋白含量与感官评分间呈极显著或显著正相关,均可作为影响贮藏品质和货架期动力学预测模型的关键因素。

表2 贮藏期间品质指标与综合感官评分之间的 Pearson 相关系数

2.10.2 反应级数的确定

利用SPSS 软件将不同温度贮藏的块菌净菜品质指标变化与时间进行线性回归拟合和相关性分析,结果如表3所示。由于失重率和腐败率初始值为零,无法使用一级函数模型进行拟合,故选用零级动力学模型。其中,基于失重率拟合零级动力学方程的R2均大于0.944,线性关系较好;基于腐败率拟合的零级动力学方程,除(-3±1) ℃的R2较差外,其余均大于0.907,线性关系较好。基于PPO活性拟合的一级动力学方程的∑R2大于零级动力学方程的∑R2,一级动力学方程拟合精度相对较高。基于可溶性蛋白含量拟合的一级动力学方程的∑R2小于零级动力学方程的∑R2,零级动力学方程拟合精度相对较高。

表3 印度块菌净菜零级与一级动力学回归速率常数k及决定系数 R2

2.10.3 货架期模型的建立

根据上述4个指标的变化规律,将-3、0、4、8、12和16 ℃换算成热力学温度(T),以 lnk和贮藏温度倒数 1/T(3.70、3.66、3.61、3.56、3.51和3.46)作图,得到有关于失重率、腐败率、PPO活性和可溶性蛋白含量的线性方程。其中,斜率为(-Ea/R) 、截距为 lnk0。由表4所示,块菌净菜的PPO活性动力学模型中决定系数R2大于0.90,拟合度较高,可作为关键品质因子建立货架期预测模型。

表4 动力学模型参数

利用线性回归方程,计算出块菌净菜的活化能Ea为4×104J·mol-1,指前因子k0为 1.24×107。将Ea和k0代入PPO活性变化的 Arrhenius方程,结果见式(4)。

(4)

2.10.4 块菌净菜货架期模型验证

将块菌净菜在不同温度下贮藏,当感官评分降为9分时记为货架期终点,即为货架期的实测值。利用货架期模型对块菌净菜贮藏期进行预测,以PPO活性为指标,将货架期的实测值和预测值进行比较,验证结果如表5所示。预测值与实测值的相对误差均在 11.05%以内,预测结果具有较高精确度。

表5 不同温度下货架期的预测值和实测值

3 结论与讨论

低温处理能有效降低印度块菌净菜贮藏期间的失重率、腐败率和呼吸强度,抑制蛋白质降解和PPO活性的增加,较好地维持贮藏期间的硬度,降低其表面微生物的生长繁殖速度。综合考虑成本、节能等因素,(0±1) ℃能较好地维持贮藏期间块菌品质,是相对最优贮藏条件。Pearson相关分析显示,失重率、腐败率、PPO活性和可溶性蛋白含量为块菌净菜品质变化的关键性因子。采用动力学模型结合Arrhenius 方程预测其货架期,其中PPO活性的拟合精度更高,决定系数R2>0.90。经模型验证实验发现,不同贮藏温度下的块菌净菜货架期实测值与预测值的相对误差均低于 11.05%,货架期预测模型较准确。在今后的研究中,可根据块菌净菜货架期的时长需求,结合实际贮藏、运输和销售条件以及消费者购买后的贮藏习惯等,进行温度条件的选择与优化,来满足其冷链物流过程中的实际需求。

一般情况下,温度越低,果蔬贮藏时间越长,但冷害发生也越严重。本研究探讨了近冰温条件下贮藏块菌净菜的效果,但温度波动对其造成了较为明显的冷害症状,导致菌体组织变软变色和出水、内部大理石花纹消失等。近冰温冷藏技术的实施需要精确的温度控制,而商业冷库的控温精度在 ±1 ℃以上,很难达到技术要求。而逐步降温能使果蔬逐渐适应低温从而减轻冷害的发生,适宜的预贮温度和时间也是低温贮藏的关键因素。可见,关于块菌净菜低温贮藏的配套技术研究还需进一步深入,这将为延长块菌的贮藏期和货架期,减少采后损失,促进经营者增加收入和推动块菌产业发展奠定基础。