云南山茶在干旱-复水过程中抗氧化酶活性变化及关键基因差异表达分析

林先玉,李紫倩,柏 松,罗 军,屈 燕,2,*

(1.西南林业大学 园林园艺学院,云南 昆明 650224; 2.国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心,云南 昆明 650224)

云南山茶(CamelliareticulataLindl.)是山茶科山茶属中观赏价值较高的一个植物类群,名列“云南8大名花”之首,有着极高的园林观赏价值,是重要的园林观赏植物[1],自然分布于云南、贵州、四川等海拔较高的山谷或背阴处,喜半阴湿润的生长环境,对炎热干旱环境反应敏感[2]。干旱作为一种逆境胁迫,能够引起植物表型、生理生化以及基因表达等一系列变化,轻度的干旱在复水后植物可以恢复生长,严重干旱则会对植物产生不可逆的伤害[3]。干旱严重制约着云南山茶的生长,增加了养护成本,不利于其进一步地推广使用。

水分缺乏会诱导光抑制致使叶绿体中活性氧产物增加[4],过多的活性氧会损害植物细胞,加速机体的衰老和死亡。抗氧化酶系统是植物受到逆境胁迫时的自我保护系统,可以通过调节自身的活性来清除过多的活性氧,进一步维持植物体内活性氧的产生和清除之间的平衡[5],酶促抗氧化系统中的SOD和POD在清除活性氧方面有着重要作用。在遭受干旱胁迫时,植物的生理生化特性和分子机制都会发生一系列的变化,植物细胞最先感知到环境的变化,并通过一系列复杂的反应,使自身结构、组织、代谢等发生变化,最终引发生理生化特性的改变。在此过程中,为对抗干旱胁迫植物细胞会通过信号转导来调控抗旱基因的表达去合成相关物质以抵御干旱,其中抗氧化酶的合成有利于清除活性氧,减少其对植物产生的损伤[6]。因此,研究抗氧化酶相关基因在干旱胁迫环境下的表达差异,有利于进一步探寻云南山茶的抗旱机制,对提高其抗旱性的研究有着重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的云南山茶种子采自云南省腾冲市富民县东村镇,25.526 7°N,102.623 0°E,海拔2 069 m,于2021年1月播种于规格为18 cm×13 cm×16 cm的塑料盆中,置于西南林业大学后山树木园温室大棚中培养。

1.2 实验方法

选取生长状况良好、长势一致且无病虫害的平均高度约为30 cm 的半年生云南山茶幼苗,采用PEG-6000(购买自天津市科密欧化学试剂有限公司)模拟干旱法进行胁迫实验。将清洗好的云南山茶幼苗置于装有1/2 Hoagland营养液(购买自沃瑞达斯实验试剂耗材店)的容器中用泡沫固定,放入培养箱中缓苗3 d。缓苗后,将云南山茶幼苗分为4组,分别加入0(对照组)、5%(轻度胁迫)、10%(中度胁迫)、20%(重度胁迫)的PEG-6000胁迫处理,每个处理重复3次,培养箱温度设置为25℃,光照强度为1 700 lx,光照时间为12 h·d-1, 湿度为70%,每天为其根部供氧2 h。分别在处理开始的0、24、48、72 h 以及复水48 h时取样,采集叶片样品用液氮快速冷冻,然后置于-80 ℃ 冰箱保存。

1.3 指标测定

SOD活性采用四氮唑蓝光还原法测定[7],POD活性采用愈创木酚法测定[7],MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[8]。

1.4 转录组测序

在重度胁迫下,云南山茶叶片POD、SOD活性的变化最为显著,为了探究云南山茶抗氧化酶关键基因对干旱胁迫及复水的响应,进一步明确关键基因的调控机制,本实验分别选取对照组0、72 h、恢复48 h(分别标记为CK-0 h、CK-72 h、CK-re48 h)以及重度干旱胁迫处理组0、24、72 h、恢复48 h(分别标记为20-0 h、20-24 h、20-72 h、20-re48 h)的样本,每个时间点3个生物学重复,共21个样本由武汉迈维生物科技有限公司进行转录组测序。

1.5 数据处理

使用Microsoft Excel处理数据并绘制柱形图、R.4.13绘制基因热图、SPSS Statistics 26软件进行相关性、显著性等分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫及复水对云南山茶叶片POD、SOD活性的影响

由图1可知,不同程度的干旱胁迫以及不同的胁迫时间对云南山茶叶片POD和SOD活性均有影响,其中POD活性变化较SOD活性更为显著。POD活性总体呈现先上升后下降的趋势,0～72 h轻度和中度胁迫持续上升,复水后有所下降。在0～48 h轻度干旱胁迫POD活性始终高于中度胁迫,72 h后中度胁迫则高于轻度胁迫;重度胁迫POD活性在0～48 h持续上升,48 h时达到峰值,48 h到复水48 h逐渐下降。SOD活性总体呈现上升趋势,其中轻度胁迫没有明显的变化,中度胁迫和重度胁迫SOD活性都显著上升。在72 h到复水48 h(恢复期间)各处理组POD和SOD活性均有所下降,对照组没有显著变化。

图上没有相同大写字母表示不同处理组同一时间点在0.05水平上差异显著(P<0.05);图上没有相同小写字母表示同一处理组不同时间点在0.05水平上差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 差异表达基因筛选

根据图2各组样本的分布情况可知,对照组和处理组样本存在明显的差异。重度干旱胁迫组24、72 h和复水48 h分布较离散,各组样本间存在较大差异性,而重度干旱胁迫组0 h以及对照组各时间样本分布较为集中,差异较小。以下重点分析重度干旱胁迫下与抗氧化酶相关的差异表达基因。

图2 主成分分析

以|log2Fold Change|>=1,且FDR<0.05为差异基因的筛选条件,在重度胁迫的条件下共筛选出61 214个差异表达基因,其中与POD相关的差异表达基因89个,与SOD相关的差异表达基因20个。0 h与72 h相比与POD相关的差异表达基因共67个,其中24个上调表达,43个下调表达;与SOD相关的差异表达基因共13个,均为下调表达。72 h与复水48 h相比与POD相关的差异表达基因共28个,其中18个上调表达,10个下调表达;与SOD相关的差异表达基因共9个,其中3个上调表达,6个下调表达。

2.3 POD、SOD活性与相关基因的相关性分析

为了进一步明确差异表达基因与POD、SOD活性的关系,将筛选出的POD、SOD相关差异基因与其活性分别进行相关性分析,结果表明,在处理期间与POD活性有显著相关性的基因有42个,其中26个为显著负相关,16个为显著正相关,说明相关基因对POD活性既存在正向调控,也存在负向调控。与SOD活性显著相关的基因有10个,均为显著负相关(表1)。

表1 POD、SOD活性与其关键基因表达量的相关性分析

2.4 POD、SOD基因表达量分析

2.4.1 相关基因KEGG富集分析

如图3所示,通过KEGG富集分析发现,POD基因集中富集于苯丙烷类生物合成通路中,是木质素合成的下游关键基因。POD相关基因在干旱胁迫及复水处理下其表达量发生了显著的变化,主要有3种变化趋势,即先上调再下调、持续下调和持续上调表达。基因Cluster 1和Cluster 3中的17个基因从0 h到复水48h呈现持续的下调表达模式,在0 h时基因表达量高,而在胁迫开始后基因表达量总体下调,在复水后48 h,基因的表达量并没有上升仍维持下调表达,这可能是由于前期干旱胁迫累积了大量的活性氧,在复水后短时间内活性氧含量仍然较高,为清除过多的活性氧,基因的表达量继续下调。基因Cluster 2中的9个基因在干旱胁迫前期(0～24 h)表达量没有显著变化,而在胁迫的后期(24～72 h)和复水期间(72 h至复水48 h)则为连续下调表达,可能由于胁迫时间的延续,24 h之后活性氧大量积累,其产生和清除之间进一步失去平衡,所以有更多的基因参与了调控。基因Cluster 4中的13个基因在胁迫前期持续低表达,在胁迫后期和复水期间则持续上调表达。基因Cluster 5中的3个基因则呈现先上调再下调的表达趋势,与POD活性变化趋势完全一致。

图3 POD基因KEGG富集通路和表达量热图

由图4所示,通过KEGG富集分析发现,SOD基因主要富集于过氧化物酶体通路中,过氧化物酶体通路在氧化还原信号传导和脂质稳态中起关键作用,参与许多重要的代谢过程,例如脂肪酸氧化、醚脂的生物合成和自由基的清除等。过氧化物酶体有着极其复杂的功能,是植物细胞内产生过氧化氢的主要场所,其自身有着一套复杂的抗氧化系统用于防御活性氧大量积累而产生的毒害[9]。SOD相关基因在干旱胁迫及复水处理下其表达量的变化均与其活性呈负相关,说明SOD基因通过降低表达量来提高SOD的活性,二者之间存在负向调控关系。0 h和24 h,基因均维持较高的表达量,而72 h和复水48 h SOD基因呈持续的下调表达模式。

图4 SOD基因KEGG富集通路表达量热图

2.4.2 相关基因表达量变化

如图5所示,POD活性总体呈现先上升后下降的趋势,在0～72 h持续上升,72 h到复水48 h逐渐下降。POD相关基因表达量变化情况较复杂,主要分为以下4种变化趋势:先下调再上调;先上调再下调;持续下调和持续上调。其中基因CrPOD6、CrPOD10等基因表达量与POD活性呈负相关,此类基因可能是POD活性的负向调控基因。基因CrPOD39和CrPOD35的表达量变化与POD活性变化一致,在胁迫期间上调复水后又下调,正向调控了POD的活性。CrPOD13、CrPOD15等与CrPOD36、CrPOD29等两类基因在胁迫期间呈现相反的表达模式,与POD活性变化存在较大差异。如图6所示,SOD活性先上升后下降,但SOD基因均为持续下调表达,与SOD活性变化并不一致。在24～72 h SOD基因表达量显著下降,而在0～24 h以及72 h到复水48 h期间变化较为缓慢。

图5 POD活性及相关基因表达量

图6 SOD活性及相关基因表达量

抗氧化酶基因对于逆境的响应是多样的,其调控方式也不唯一,不同基因之间需要协调合作,共同完成调控。部分基因对于干旱胁迫的应答时间较早,在受到胁迫初期就能迅速作出响应,而部分基因则在胁迫中后期才参与调控,因此,会出现与抗氧化酶活性变化不一致的现象[10]。

2.4.3 差异基因qRT-PCR验证

为验证转录组数据的准确可靠性,本文随机选取9个差异性表达的基因进行qRT-PCR验证,使用Primer Premier 6.0设计引物,引物序列见表2。荧光定量反应体系参照擎科生物2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)。以Actin为内参,仪器为LightCycler®480荧光定量PCR仪。采用2-ΔΔCT法计算表达量。

对选取的9个基因进行qRT-PCR验证,如图7所示,9个基因的表达趋势与RNA-seq结果基本一致,表明RNA-seq结果可信度较高。

图7 荧光定量验证基因表达量分析

3 讨论

3.1 干旱胁迫对云南山茶叶片抗氧化酶活性的影响

SOD作为清除活性氧的第一道防线,有着极其关键的作用,使CAT和POD能更好地将H2O2歧化为H2O和O2,从而降低超氧阴离子对植物细胞的损伤[11]。不同植物在遭受干旱胁迫时抗氧化酶活性变化不同,有的随着干旱胁迫程度的加剧以及干旱时间的延长呈持续上升的趋势[12],有的则表现出先上升后下降的趋势[13]。在本实验中处理组云南山茶叶片POD和SOD活性总体呈现先上升后下降的趋势,这与弓萌萌等[14]关于干旱胁迫对红树莓(RubusidaeusL.)幼苗根际酶活性的影响以及安钰等[15]关于干旱胁迫及复水对甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)叶片抗氧化酶活性的研究结果一致。在干旱胁迫前期(0～24 h)轻度胁迫和中度胁迫POD和SOD活性没有显著变化,而在干旱胁迫中期(24～48 h)和后期(48～72 h)两者都显著上升,说明短期内轻度胁迫和中度胁迫对云南山茶产生的损害小,抗氧化酶对其响应不明显,而随着胁迫时间的延长,轻度胁迫和中度胁迫也会产生大量活性氧损害其机体,POD和SOD活性随之升高。

重度干旱胁迫下,胁迫期间POD和SOD活性变化趋势有所差异,POD活性呈现先上升后下降的趋势,与赵英等[16]的研究结果一致,但SOD活性则持续上升。由于重度干旱胁迫导致云南山茶叶片中活性氧的积累更快且积累量更大,为清除过多的活性氧,POD活性在48 h时达到最高,而长期严重的干旱胁迫可能会导致抗氧化酶系统遭到损害,无法继续正常对抗干旱,所以处理48 h后POD活性持续下降。而SOD活性则在72 h时达到峰值,说明在整个干旱胁迫过程中SOD持续作用以对抗干旱胁迫。

在复水后各处理组均得到不同程度的恢复,POD和SOD活性总体呈下降趋势,这与何凤等[17]关于杜仲在干旱胁迫复水后结论一致。轻度干旱胁迫逐渐趋近对照水平,但中度和重度干旱胁迫组始终未能恢复到胁迫之前水平,说明中度和重度干旱胁迫72 h后对云南山茶造成了短期内不可逆的伤害。

3.2 重度干旱胁迫对云南山茶叶片抗氧化酶基因表达的影响

抗氧化酶相关基因调控机制十分复杂,通常由位于不同亚细胞区室的同工酶协同影响,尤其是SOD还受到不同金属离子活性结合区的影响[18],因此,基因的表达模式往往也是复杂多样的。在本实验中,POD和SOD活性呈现先上升后下降的趋势,在胁迫过程中随着时间的延长二者活性持续上升,在复水后其活性开始下降。而POD、SOD相关基因表达量均在胁迫24～72 h时发生显著变化,说明在重度干旱胁迫下云南山茶抗氧化酶相关基因参与了对干旱的调控。与曾令霜等[19]研究结果一致,POD、SOD相关基因表达量的变化趋势和时间与其活性的变化存在不一致性,可能是由于植物信号传导需要一定时间以及一些其他因素的干扰而导致的。如图5所示,部分POD相关基因在干旱胁迫的前期和中期都为低表达而干旱胁迫后期特别是复水期间持续高表达,说明该部分基因与严重干旱胁迫的抵御以及干旱后的恢复密切相关,这与早熟禾(PoaannuaL.)叶片抗氧化酶活性和基因表达模式对干旱及复水的响应结果一致[20]。此外,还有大部分POD相关基因在干旱胁迫前期高表达而干旱胁迫后期以及复水期间都持续下调表达,这与SOD相关基因表达模式一致。说明此类基因与抗氧化酶系统之间存在着负向调控的关系,在遭受逆境胁迫时通过降低基因的表达量以提高植株对于逆境的抵抗[21]。

3.3 重度干旱胁迫下云南山茶叶片抗氧化酶相关基因富集通路

在重度干旱胁迫下,云南山茶叶片抗氧化酶相关基因集中富集于苯丙烷类生物合成通路和过氧化物酶体通路中。苯丙烷类生物合成代谢途径是重要的植物次级代谢途径之一,其代谢产物在调控植物适应环境变化的过程中发挥着重要作用[22]。在POD相关基因富集的上游依次为酸类物质、辅酶类、醛类物质和醇类物质,而醇类物质被称为单木质素,是木质素生物合成的起始化合物;而下游均合成了木质素,木质素是植物苯丙烷代谢途径中合成的一类重要产物,也是公认的高效抗氧化剂,有着较好的清除自由基的性能[23]。由于云南山茶遭受了干旱胁迫,体内活性氧大量积累,细胞膜脂逐渐过氧化,为了降低自由基对植物的伤害,抗氧化酶基因通过调控其表达量来合成相关物质,以缓解干旱胁迫带来的损伤。

云南山茶在受到干旱胁迫时,会开启一系列的自我防御和对抗机制,其中抗氧化酶系统在对抗干旱胁迫中起到重要作用,抗氧化酶基因在胁迫期间的差异表达说明抗氧化酶基因受干旱胁迫的诱导并作出了应答,积极响应干旱胁迫。