化学诱变获得甘蓝型油菜矮秆突变新种质

郎春秀,刘仁虎,郑 滔,王伏林,石江华,胡张华,吴关庭,*

(浙江省农业科学院 a.病毒学与生物技术研究所; b.作物与核技术利用研究所,浙江 杭州 310021)

油菜是我国主要油料作物之一,在我国食用油生产中占有举足轻重的地位。油菜尤其是杂交油菜植株较高,易发生倒伏,倒伏会影响植株生长发育,导致产量和品质下降,而且植株高大和倒伏也不利于机收[1-3]。在兼顾产量与抗倒性的前提条件下使油菜适度矮化既有利于保障油菜的高产稳产和品质,也有助于促进油菜机械化生产的发展。油菜矮化育种需要有优异适用的矮秆种质资源作为基础,但相比水稻、小麦等禾本科作物,油菜中发现的矮源十分有限,具有较大育种利用价值的核心矮秆种质更是匮乏。因此,发掘、创制新的油菜矮秆资源对于培育高产、抗倒、适于机收的适度矮化品种具有重要意义。理化诱变是创造包括矮秆突变在内的各种植物变异的一个有效手段,迄今已在植物种质资源创新和优新品种选育中发挥了重要作用[4-5]。甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulphonate,EMS)是一种在许多植物的诱变研究中广泛应用的强化学诱变剂,诱变处理操作简单,成本低廉,其诱发的点突变频率较高而染色体畸变相对较少[6-7]。在油菜中利用EMS诱发产生矮秆突变已有一些文献报道[2,6,8-13]。作者团队开展EMS诱发油菜重要农艺性状突变研究多年,获得了矮秆、不育、黄籽等多种类型的、有利用价值的突变材料,本文介绍其中的矮秆突变体的相关研究结果。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究诱变亲本选用浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所育成的甘蓝型油菜双低高油品种浙油50,其株高约为157 cm左右[14]。实验室保存的该品种已套袋自交多年,遗传纯合稳定。化学诱变剂EMS购自美国Sigma公司,原液浓度为10 mmol·L-1。赤霉素GA3购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EMS诱变处理

挑选浙油50健康饱满干种子2份,每份2 000粒。将种子置于烧杯中,加入蒸馏水至完全浸没,10 h后倒掉蒸馏水在滤纸上吸干种子表面水分。以浓度为0.1 mmol·L-1、pH值7.0的磷酸缓冲液配制0.5%和1.0%的EMS溶液,在22 ℃左右的室温下分别处理已预浸过的种子8 h。浸种处理完毕用蒸馏水冲洗种子数次,流水冲洗过夜,以去除种子表面残留的EMS,然后将种子晾干后备播。

1.2.2 诱变材料种植与筛选

2014年3月以条播方式将经过两种浓度EMS处理的油菜种子直播于青海省互助县,出苗成活的M1植株在开花时逐株套袋,成熟后单株收获主花序自交种子。同年10月至2016年5月,从每个收获单株中分别取少量种子混合,在浙江省安吉县连续两季采用集团法种植M2代开展突变体筛选,M2群体大小为1.8万～2.0万株,以相邻种植的诱变亲本浙油50作为对照。苗期、现蕾期、开花期和灌浆期分别对整个群体进行全面、仔细的表型性状变异调查,发现的变异株逐一挂牌和记录。成熟后先逐株收取挂牌植株,然后将其余能收获一定数量种子的植株也按株全部收回,供室内调查种子大小和种皮色变异以及采用近红外分析方法筛选品质性状变异。入选的M2变异单株种成M3株系,M3及以上世代每株系种植24株,各生育阶段对变异株系进行观察、鉴定和筛选,直至获得变异性状稳定的突变体。

1.2.3 表型特征考察

已遗传稳定的两个矮秆突变体及其原始亲本于2020年10月12日播种,11月18日移栽,每个材料种植200株左右,常规栽培管理。翌年3月开花后观察记录开花期,成熟后从各群体中随机取样考查株高、一次分枝位、一次分枝数、二次分枝数、每株角数、角果长度、每角粒数、千粒重和单株产量共9个性状,3次重复,每重复10株。

1.2.4 脂肪酸组分分析

在美国THERMO FISHER公司生产的TRACE 1300气相色谱仪上采用脂肪酸甲酯的毛细管气相色谱法[15]分析两个矮秆突变体及其原始亲本的种子脂肪酸组分,每一材料重复测定3次。按照峰面积归一化法计算各脂肪酸组分的相对含量,以单一脂肪酸占总脂肪酸的百分比表示。

1.2.5 含油量测定

两个矮秆突变体及其原始亲本的种子含油量采用索氏抽提法测定[16],每一材料独立取样,重复测定3次。

1.2.6 突变遗传分析

两个矮秆突变体分别与正常株高品种浙油50和浙双72正反交配制成8个组合,将这些组合及其配组亲本的种子播种于大田,考察F1代表型特征并测量株高。从各组合中分别随机选取一个主花序套袋自交的F1单株播种成F2群体,移栽时先根据表型特征观察记录群体内幼苗分离情况,然后从每一组合中随机挑取分离出来的矮生苗和正常苗各50株种植于大田,观测成熟植株株高。试验结束后对F2代苗期幼苗分离数据进行卡平方测验。

1.2.7 光暗形态建成观测

参考宋稀等[1]的方法,将泥炭土、珍珠岩和蛭石按4∶3∶3的体积比混匀后等量分装于培养钵,然后挑取两个矮秆突变体及其原始亲本的健康饱满种子各16粒播于其中,在26 ℃恒温的培养室内培养。光照条件设置2个处理,即16 h光照/8 h黑暗和24 h黑暗(纸箱及黑布遮光),3次重复,培养7 d后观察幼苗表型并测量下胚轴长度。

1.2.8 赤霉素敏感性测验

将两个矮秆突变体及其原始亲本的健康饱满种子播于装有等量体积、按4∶3∶3的体积比充分混匀的泥炭土、珍珠岩和蛭石的培养钵中,每钵16粒,然后置于26 ℃培养室内恒温培养,光照条件为16 h光照/8 h黑暗。播后第5 d子叶稍展开时第一次喷施赤霉素GA3,以后每隔1 d喷施1次,GA3喷施浓度为10、100、200、500和1 000 mg·L-1,以喷施清水作为对照,每个处理3次重复。播后12 d和21 d添加等量稀释1 000倍的营养液, 25 d时测量幼苗下胚轴长度。

1.2.9 数据统计分析

在Microsoft Office Excel 2007中采用F-检验和t-检验方法对两个矮秆突变体及其原始亲本的主要农艺性状、种子脂肪酸组成与含油量以及幼苗下胚轴长度等数据进行统计学比较分析。

2 结果与分析

2.1 矮秆突变体的获得

2014年3月诱变种子播种后,1.0% EMS处理的M1代因生理损伤严重成苗极少,后弃用,而0.5% EMS处理的M1代则有略高于40%的成株率,最终收回了800余个主花序套袋自交单株用于M2代突变体筛选。在2015—2016年第二次种植的M2群体中,共筛选获得9个角果短粗单株。2016—2017年将这些单株种成M3株系,其中的一个株系(编号3060)除继续保持角果短粗以外,还表现出矮秆性状,其株高较原始亲本浙油50(编号ZY50)大幅度下降,而且单株之间表现一致,未出现分离现象。另有一个株系(编号3056)则分离成两类植株,一类是角果短粗、株高显著矮化的植株,另一类为角果长度和株高均属正常的植株。2017—2018年将该株系中的矮秆株种成M4株系(编号4036),角果短粗和矮秆突变性状不再分离。至此,获得两个表型性状基本稳定的矮秆突变体3060和4036。2018—2021年连续3年观察表明,这两个突变体在诸多表型性状上存在差异。

表1 两个矮秆突变体及其原始亲本的主要农艺性状

2.2 矮秆突变体表型特征

在苗床育苗和移栽到大田后的前期生长阶段,两个矮秆突变体呈现矮壮、叶厚、叶皱、叶色较深等特征,与原亲本浙油50差异十分明显。同日播种、移栽和相同栽培条件下,两突变体3060和4036的开花期分别要比原亲本晚8 d和11 d(表1)。成熟后取样考种结果表明,两突变体株高仅为74.5 cm和72.0 cm,相比原亲本降低50%以上,株型紧凑直立,分枝夹角小。同时,一次分枝位相应下移,一次分枝数、二次分枝数、每株角数和每角粒数减少,角果长度缩短,千粒重发生改变,单株产量下降,这些性状与原亲本的差异大多达到0.05或0.01水平上显著(表1)。两突变体之间的农艺性状亦有一定差异,主要表现在一次分枝位、千粒重和单株产量上。4036的千粒重为3.27 g,低于原亲本0.76 g,而3060的千粒重则有4.62 g,高于原亲本0.59 g,比4036要高出1.35 g,这是3060的单株产量明显高于4036的主要原因。另外,从表1还可以看出,虽然两突变体株高和角果长度的降幅很大(46.4%～53.5%),但每株角数和每角粒数的减幅相对较小(12.8%～20.3%),这主要归因于两突变体着角密度和着粒密度的提高。

2.3 矮秆突变体品质性状

脂肪酸组分分析结果表明,两个矮秆突变体3060和4036之间除了亚麻酸含量以外,其他6种脂肪酸含量的差异均达0.01水平显著,其中3060的棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸含量极显著低于4036,而花生烯酸和芥酸含量极显著高于4036(表2)。虽然突变体4036的硬脂酸、亚油酸和亚麻酸含量与原亲本的差异达到了0.05或0.01水平上显著,但两材料的脂肪酸组成总体上还是相似,均具有油酸含量高、二十碳以上极长链脂肪酸含量极低的特点。与原亲本相比,突变体3060的脂肪酸组成发生了显著变化,7种主要脂肪酸中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸含量显著或极显著降低,尤其是油酸含量从原亲本的67.81%下降到了41.15%,花生烯酸和芥酸这两种极长链脂肪酸含量则从原亲本的不足1%提高到了33.18%。两个矮秆突变体的种子含油量相仿,约为42%左右,均极显著低于原亲本(表2)。

表2 两个矮秆突变体及其原始亲本的种子脂肪酸组成与含油量

2.4 矮秆突变遗传控制

将两个矮秆突变体分别与原亲本浙油50和另一常规双低品种浙双72正反交,各组合F1代生长前期的长相与两常规亲本相似,不表现两矮秆突变体的表型特征,移栽到大田后,成熟植株株高也与两常规亲本相仿,没有统计学上的显著差异。而在F2代苗期群体中,各组合均分离出两类明显不同的幼苗,一类是具有矮秆突变体表型特征的矮生苗,另一类是与两个常规亲本幼苗相似的正常苗,对各组合中两类苗的数量进行统计,所得数据列于表3。从每一组合中随机选取相同数量的矮生苗和正常苗种植于大田,成熟后观测株高,证实由矮生苗长成的植株均为矮秆类型,而正常苗都长成株高在正常范围内的植株。基于该验证结果,对表3幼苗分离数据进行卡平方测验,所有组合中除4036/ZS72以外,其他7个组合的概率值均大于0.05,说明这些组合中正常苗与矮生苗的分离符合3∶1的期望比率。这一研究结果初步表明,3060和4036矮秆突变受单个隐性基因或隐性主基因控制,不存在细胞质效应。

表3 两个矮秆突变体与两个常规品种正反交F2苗期分离的卡平方测验

2.5 矮秆突变体幼苗光暗形态建成

将两个矮秆突变体及其原始亲本分别置于光照和黑暗条件下培养7 d后量取的下胚轴长度如图1所示。从图1可以看出,两种培养条件下,突变体3060和4036的下胚轴长度均极显著小于原始亲本浙油50(P<0.01),另一方面,暗培养条件下每一材料的下胚轴长度都要极显著大于光照培养(P<0.01)。暗培养幼苗的子叶黄化,外形呈闭合弯钩状,未见真叶,而光照培养幼苗的子叶呈绿色,平直伸展,有真叶发生(图2)。这一试验结果表明,两个矮秆突变体幼苗的光暗形态建成正常。拟南芥与油菜近缘,在拟南芥油菜素内酯合成突变体中的研究发现,暗培养条件下,该类突变体幼苗呈现出下胚轴缩短、子叶伸展真叶出现、顶端弯钩消失、脱黄化等非正常形态建成[17-19]。据此推测,本研究获得的突变体3060和4036的矮化机制可能不涉及油菜素内酯途径。

ZY50,浙油50。**表示与ZY50相比差异极显著(P<0.01)。下同。

A,光照;B,黑暗。

2.6 矮秆突变体对外施赤霉素的响应

两个矮秆突变体及其原始亲本播种出苗后,喷以不同浓度的GA3溶液以探明幼苗下胚轴伸长对外施赤霉素的响应。试验结果表明(图3),喷施外源GA3后,原始亲本浙油50的下胚轴长度有随着GA3浓度的提高而略有增加的趋势,当GA3浓度达到1 000 mg·L-1时,下胚轴长度较喷施自来水的对照增加7.8%,但经t检验各GA3浓度的下胚轴长度与对照之间的差异均未达显著水平。因此,浙油50下胚轴伸长对外施赤霉素的反应可归为不敏感类型。外源GA3喷施对两个矮秆突变体下胚轴伸长有明显促进作用,而且在本试验浓度范围内促进作用随浓度的提高而增强。GA3浓度为10 mg·L-1时,4036和3060的下胚轴长度分别比对照增加8.1%和16.0%,差异达显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平。当浓度上升到1 000 mg·L-1后,两突变体的下胚轴分别伸长至6.0 cm和8.6 cm,相比对照增加了43.1%和77.6%,但均未能恢复到原始亲本的长度。由此结果认为,两个矮秆突变体的下胚轴伸长对外施赤霉素敏感,且3060的敏感性比4036更强。

*表示与ZY50相比差异显著(P<0.05)。

3 讨论

本研究利用EMS诱变处理双低高油甘蓝型油菜品种浙油50,从其后代中成功筛选出两个矮秆突变体3060和4036。两突变体来自于两个不同的M2变异株,由于M2代是采用混合种子集团法种植,所以这两个变异株是否源于同一个M1单株已不得而知。但考种结果表明,两突变体之间包括开花期在内的多个农艺性状存在不同程度的差异,尤其是一次分枝位、千粒重和单株产量等性状差异明显。在两突变体的种子脂肪酸组成中,棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生烯酸和芥酸等6种脂肪酸的含量均有极显著差异。此外,3060的幼苗下胚轴伸长对外施赤霉素的敏感性要强于4036。综合这些结果来看,矮秆突变体3060和4036应该是产生于两个相互独立的突变事件。

植物株高的遗传控制复杂,而且易受环境条件的影响。迄今有关油菜矮秆性状的遗传研究已有一些文献报道,但报道的结果多有不同。少数研究结果表明,油菜矮秆性状受多基因控制[20-21],而多数研究认为是单基因遗传,其基因效应可以有隐性[2,22]、显性[12-13,23]、不完全显性[24-26]和加性[8]等多种类型。另外,还有研究发现,油菜的矮生性受一对主基因控制,其基因效应包括加性为主[27]、加性-显性[1]、部分显性[28]和显性[29]等,在受一对主基因控制的同时,还存在有微效基因或修饰基因的影响[28-29]。本研究基于两个矮秆突变体与两个正常株高品种正反交F1代表现、F2代苗期幼苗分离情况和成熟期株高观测结果,明确矮秆突变性状为隐性,并初步判断是单个核基因遗传。但在F2代株高观测时也注意到,矮秆株和正常株两类植株中,单株之间株高有一定幅度的变异,这种变异有可能是外界环境条件等非遗传因素影响所致,亦有可能是矮秆性状受单个隐性主基因控制、同时又有微效基因在起作用。

研究表明,植物中的许多矮化突变与体内激素赤霉素和油菜素内酯的生物合成或信号传导有关,少数则与生长素相关[30]。在油菜中,目前已报道的矮秆突变体的矮化大多与赤霉素[5,22,31-32]或者生长素[33-34]信号减弱有关。依据对外源赤霉素的响应,油菜矮秆突变体可大致归为三种类型:赤霉素不敏感型[22,24,35]、赤霉素敏感性减弱应答型[1-2,5]和赤霉素敏感型[36]。本研究中的两个矮秆突变体光暗形态建成正常,根据前人在油菜近缘植物拟南芥中的相关研究结果推测这两个突变体的矮化可能与油菜素内酯途径无关。外施赤霉素对两突变体幼苗下胚轴伸长有显著促进作用,表明与原始亲本相比,两突变体对外源赤霉素反应敏感,可视为赤霉素敏感类型,但另一方面试验也发现,外源赤霉素喷施并不能使两突变体的幼苗下胚轴伸长完全恢复到原始亲本的水平,由此推断,本研究获得的两矮秆突变可能与赤霉素信号传导过程中的变异有关。

诱发创制有利用价值的优异突变新种质是本次EMS诱变研究的目的所在。基于多年观察、农艺性状考查和品质分析结果,矮秆突变体3060和4036的平均株高均超过70 cm,株型紧凑直立,分枝夹角小,而且前者3060千粒重大,仍具有相对较高的产量水平,后者4036种子中油酸含量高,包括芥酸在内的极长链脂肪酸含量极低,这些特征特性赋予两个突变体一定的利用价值。一方面,独特的株高和株型使得这两个突变体比较适合于在果园以及其他不宜播种正常高秆油菜的地方种植,管理方便,不会倒伏,不会影响果树生长,同时又可服务于农旅观光。另一方面,两突变体在油菜杂交育种中的应用潜力亦值得去发掘。由于3060和4036的矮秆突变性状也可能受控于单个隐性主基因及微效基因,所以在其与正常株高品种杂交的后代中还是有望筛选出分枝夹角较小、株型紧凑、株高适度矮化、适合机械化生产的新材料乃至新品种。目前,该项研究工作已在进行之中。