铁皮石斛的黄酮类成分测定及其生物可及性研究

孙凤婷,许振岚,朱作艺,张春荣,汤 涛,赵学平,盛 清,王 强,*

(1.浙江理工大学 生命科学与医药学院,浙江 杭州 310018; 2.农业农村部农药残留检测重点实验室,浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所,浙江 杭州 310021)

铁皮石斛是兰科草本植物,收载于《中华人民共和国药典》,至今已有2 000多年的历史,其主要分布在贵州、云南和广西等地,具有明显的抗肿瘤、降血压、降血糖、抗氧化、延缓衰老、增强免疫力等药理作用,在现代医学上有广泛的应用[1-3]。黄酮类化合物是铁皮石斛中重要的次级代谢产物,也是一类重要的活性物质。闫建华等[4]研究铁皮石斛总黄酮对D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影响,研究发现,铁皮石斛总黄酮可有效调节模型小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、三磷酸腺苷(ATP)活性,降低过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,揭示了铁皮石斛黄酮的抗衰老机制与降低氧化应激反应有关。姜一鸣[5]研究发现,铁皮石斛黄酮化合物,能恢复小鼠运动后免疫功能。目前,在铁皮石斛已鉴别出38个黄酮单体成分,主要包括柚皮素、槲皮素和圣草酚等[6],然而,黄酮类含量测定主要采用比色法测定总黄酮含量,不能提供黄酮单体的含量信息。马旖旎[7]测定了7个产地的铁皮石斛中的总黄酮含量,含量在0.340%～0.991%。UPLC、UPLC-MS/MS、UPLC-QTOF-MS已被用于石斛中黄酮类成分的分离鉴定和含量检测。刘莉彬等[8]利用高效液相色谱技术建立了霍山石斛黄酮组分的UPLC指纹图谱分析鉴别方法。吕朝耕等[9]测定了不同产地铁皮石斛中芦丁、柚皮素和槲皮素等10个黄酮类成分,结果显示,不同样品在黄酮类成分的组成、含量方面存在较大的差异。目前所报道的检测方法中,均为样品提取后直接过膜检测,没有净化过程,可能会导致色谱峰共流出、色谱柱柱效降低、仪器污染等问题。因此,需要针对铁皮石斛中黄酮单体建立精准检测方法。

目前,文献报道的铁皮石斛中黄酮的含量均基于有机溶剂提取后的测定值,无法真实反映铁皮石斛黄酮在消化过程中的释放情况,即其生物可及性。体外模拟消化能够反映活性成分被生物体的利用情况,相对体内实验,具有快捷简便、成本低和重现性好的特点[10],因此被研究者采用。梅娜娜等[11]利用体外消化模型研究了金钗石斛碱、多糖和多酚类物质在消化过程中的变化,发现多酚类物质含量在胃模拟消化液中最高,在模拟肠道消化中降低。张冠亚等[12]研究了体外模拟消化液对于铁皮石斛中多糖的消化作用,结果表明在体外模拟胃肠道的消化体系中,铁皮石斛多糖的分子量减小,糖苷键发生断裂,但没有游离单糖的释放。铁皮石斛中的黄酮类化合物的体外消化研究鲜有报道,并且在以上研究中采用的模型为胃和小肠消化模型,而食物在结肠中的停留时间约占食物通过人体消化道的持续时间的80%,在胃肠中不被消化的黄酮类物质可能进入结肠而被进一步消化释放,进而被结肠微生物分解代谢而被生物体利用[13]。

本研究建立固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定铁皮石斛中17种黄酮单体化合物,收集10批次的铁皮石斛样品,测定总黄酮和17个黄酮单体的含量,并比较黄酮类化合物含量的差异。利用体外消化模型研究了铁皮石斛在胃-小肠消化和结肠消化中黄酮类化合物的释放情况,分析消化过程中铁皮石斛中黄酮类化合物的生物可及性及抗氧化活性的变化,探究黄酮类化合物与抗氧化活性之间的相关性,为铁皮石斛黄酮类成分的活性研究和作为一种功能性食品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究所用材料为铁皮石斛的茎,从不同产地收集了10批次的铁皮石斛样品,编号为TP1～TP10,具体信息见表1,所有材料经刘宇文副主任中药师鉴定为兰科植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的茎。铁皮石斛干茎和枫斗直接用粉碎机进行粉碎。铁皮石斛鲜茎先用烘箱在80 ℃的条件下烘烤24 h后粉碎。

表1 铁皮石斛样品的具体信息

亚硝酸钠,杭州高晶细化工有限公司;硝酸铝,麦克林公司;氢氧化钠,兰溪市屹达化工试剂有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、2,4,6-(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)、水溶性维生素E(Trolox)、过硫酸钾、氯化铁、醋酸和醋酸钠,百灵威科技有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、猪胆盐和黏蛋白,美国Sigma公司;柚皮素、芹菜素、木犀草苷、槲皮素、圣草酚、异鼠李素、槲皮苷、芦丁,橙皮素、异槲皮苷、山柰酚、芹菜苷、金丝桃苷、夏佛塔苷、紫杉叶素和柚皮苷,上海安谱实验科技股份有限公司;金圣草黄素,上海丁百生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

三重四极杆液相色谱-质谱联用、UV1900紫外分光光度计,日本岛津公司;METTLER TOLEDO电子天平,奥豪斯国际贸易有限公司;KUDOS超声波清洗机,上海科导超声仪器有限公司;TD5A-WS离心机,江苏省金坛市金南仪器制造有限公司;涡旋振荡机,泰州诺米医疗科技有限公司;粉碎机,上海屹立五金工具有限公司;旋转蒸发仪,上海申胜生物技术有限公司;pH计,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;恒温振荡器,太仓市实验设备厂;真空冷冻干燥机,青岛永合创信电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛中黄酮类物质的提取

准确称取0.2 g铁皮石斛样品,加入75%乙腈8 mL,涡旋5 min,超声提取30 min,5 000 r·min-1离心5 min得上清液备用。

1.3.2 总黄酮含量的测定

铁皮石斛中总黄酮含量测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[14],取2 mL提取液加入到试管中,加入0.3 mL 5%(质量分数)NaNO2溶液,充分混匀后反应6 min,加入0.3 mL 10%(质量分数)Al(NO3)3溶液,涡旋混匀,静置6 min后,再加入4 mL 4%(质量分数)NaOH溶液,涡旋混匀后在510 nm处测定吸光度。用芦丁标准品配置系列浓度的标准溶液,按上述方法测定吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线Y=0.004 0X-0.008 9(R2=0.998 8),利用标准曲线计算样品中的总黄酮含量。

1.3.3 17种黄酮单体含量的测定

(1)提取液的净化

将1.3.1节得到的上清液全部转移至圆底烧瓶中,旋转蒸发至1 mL左右,然后用0.1%甲酸水稀释至5 mL。取2 mL稀释后的样品上样至Oasis HLB(3 mL,60 mg)固相萃取柱(上样前分别用3 mL甲醇、3 mL纯水活化),弃掉流出液,用2 mL 5%甲醇淋洗,最后用4 mL甲醇分2次洗脱,每次2 mL,将洗脱液旋蒸近干后用2 mL甲醇进行定容。

对于柚皮素、芦丁、夏佛塔苷这3种含量较高的黄酮单体,样品用甲醇稀释100倍后过0.22 μm的滤膜用于检测,对于其他含量较低的黄酮单体,样品直接过0.22 μm的滤膜后进样检测。

(2)仪器条件

液相条件:色谱柱:UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流动相:2 mmol·L-1乙酸铵0.1%甲酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱程序:0～0.5 min,0～10% B;0.5～3.0 min,10%～85% B;3～5 min,85%～95% B;5～9 min,95%～95% B;9.00～9.01 min,95%～10% B;流速0.25 mL·min-1,柱温40 ℃,进样量2 μL。

质谱条件:质谱系统配备了电喷雾电离源(ESI)。雾化气和干燥气为氮气(99.95%),流速分别为3.0 L·min-1和10.0 L·min-1。加热气为空气(99.95%),流速为10.0 L·min-1。碰撞气为氩气(99.99%),压力为270 kPa。其他参数为:接口电压4.0 kV,接口温度300 ℃,脱溶剂温度250 ℃,加热块温度400 ℃,检测器电压1.82 kV。采用多反应监测(MRM)模式进行数据采集,用于定量和定性的离子对以及碰撞能(collision energy)和保留时间见表2。

表2 黄酮类化合物的MS/MS参数(电离模式,ESI-)

1.3.4 模拟体外消化及生物可及性分析

参照Cui等[15]的方法模拟人体消化道的3个部分(即胃、小肠和结肠),测定铁皮石斛中黄酮类物质的生物可及性。各部分消化液的成分见表3。称取0.2 g铁皮石斛,置于50 mL离心管中,加入20 mL胃模拟消化液,用2 mol·L-1HCl调pH值至2.5,混匀,置于37 ℃恒温振荡器中80 r·min-1振摇1 h。振荡结束后,加入碳酸氢钠固体调节pH值至7.0,加入胰蛋白酶(2 mL,5 g·L-1)和胆盐(2 mL,17.8 g·L-1),混匀,置于37 ℃恒温振荡器中80 r·min-1振摇4 h,4 000 r·min-1离心10 min,上清液为胃-小肠消化后的样品,残渣中加入20 mL预热的结肠模拟消化液,用2 mol·L-1HCl调pH值至6.5,混匀,置于37 ℃恒温振荡器中80 r·min-1振摇8 h,4 000 r·min-1离心10 min,上清液为结肠消化后的样品。将消化后的样品冷冻干燥并用甲醇复溶,用于总黄酮、黄酮单体、抗氧化活性的测定[16]。

生物可及性是指在体外模拟消化过程中释放的化合物的量与样品中化合物的量的比值。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参照Zhang等[17]的方法。取1 mL样品溶液,加入5 mL 200 mmol·L-1的DPPH溶液,涡旋混匀,室温暗反应30 min后用紫外分光光度计测定510 nm处的吸光度,记为D1,同时测定空白的吸光度(用1 mL蒸馏水代替样品溶液),记为D0。DPPH自由基清除能力按照下述公式计算:DPPH自由基清除率(%)=(D0-D1)/D0×100%。以Trolox作为标准品绘制标准曲线Y=1.357 9X-1.433 3(R2=0.997 8),DPPH自由基清除能力以铁皮石斛干样中所含Trolox当量表示。

1.3.6 FRAP总抗氧化能力的测定

FRAP总抗氧化能力的测定方法[18]为:将10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1氯化铁溶液和300 mmol·L-1醋酸钠缓冲液(pH 3.6)以体积比为1∶1∶10混合得到FRAP工作液。吸取0.2 mL样品溶液,加入5 mL FRAP工作液,涡旋混匀,37 ℃避光反应8 min后用紫外分光光度计测定593 nm处的吸光度。以Trolox作为标准品绘制标准曲线Y=0.006 1X+0.016 8(R2=0.999 1),FRAP总抗氧化能力以铁皮石斛干样中所含Trolox当量表示。

1.3.7 统计分析

使用Origin 2018软件绘图,SPSS 25.0软件进行数据分析,相关性分析采用Spearman法,*显著相关,P<0.05;**极显著相关,P<0.01。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

根据国际协调会议(ICH)和国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的准则对方法进行线性、灵敏度、准确性和精密度的验证,即ICH《Q2(R2):分析方法验证》和文献[19]。

2.1.1 线性范围、检测限和定量限

通过配制不同浓度的黄酮单体化合物标准工作溶液建立标准曲线来评估线性,所有化合物的相关系数(R2)均大于0.99。以检出限(LOD)和定量限(LOQ)评价所建立方法的灵敏度,信噪比(S/N)等于3和10时所对应的浓度分别为最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ),黄酮类化合物的LOD为0.62～8.38 μg·kg-1,LOQ为2.05～27.93 μg·kg-1。

2.1.2 回收率和精密度

将17个黄酮类化合物本底值的0.8倍、1倍、1.2倍分别作为低、中、高3个添加水平,用回收率评价其准确性,回收率计算公式为:回收率(%)=(测定量-原始量)/加入量×100%。用相对标准偏差评定日内精密度和日间精密度,在同一天进行的回收率试验(n=5),得到回收率的相对偏差为日内精密度;连续3 d进行回收率试验(n=15),计算得到回收率的相对标准偏差为日间精密度。该方法的17种黄酮类化合物的回收率为75%～117%,日内精密度为4.8%～11.0%,日间精密度为6.1%～12.6%。结果表明,本方法具有较好的回收率和精密度,可满足铁皮石斛黄酮类物质的检测要求。

2.2 铁皮石斛中总黄酮含量

10批次铁皮石斛中总黄酮含量如图1所示,样品中总黄酮的含量为1.52～4.36 mg·g-1,其中总黄酮含量较高的铁皮石斛样品是TP3(广西巴马),含量较低的是TP10(浙江乐清)。马旖旎[7]研究了云南、浙江、广东和湖南产地的铁皮石斛中的总黄酮含量,其范围为0.064%～0.395%,其中广东产地的含量最高,浙江产地的含量最低,与我们的研究结果相近。

图1 铁皮石斛中总黄酮含量

10批次铁皮石斛样品中的17个黄酮单体含量如表4所示。柚皮素、芦丁和夏佛塔苷含量较高,分别为11.97～37.89 mg·kg-1、9.87～201.08 mg·kg-1和7.06～278.23 mg·kg-1,芦丁含量在大多样品中是最高的。剩余的14个黄酮单体在铁皮石斛中的含量较低,其含量总和为2.57～14.39 mg·kg-1。Sui等[20]从铁皮石斛中鉴定出了14种黄酮类化合物,其中芦丁的含量最高,这与我们的研究基本一致。柚皮素在TP7(云南文山)样品中含量较高,在TP5(贵州赤水)中含量较低;芦丁在TP5(贵州赤水)样品中含量较高,在TP7(云南文山)中含量较低;夏佛塔苷在TP4(福建漳州)样品中含量较高,在TP10(浙江乐清)中含量较低,其他黄酮单体的含量信息见表4。

表4 铁皮石斛中黄酮单体的含量

2.3 铁皮石斛中黄酮的生物可及性

如图2所示,铁皮石斛样品经过胃-小肠消化后,总黄酮的释放量为0.24～0.70 mg·g-1,生物可及性为13.75%～21.45%。样品经过进一步结肠消化后,总黄酮的释放量为0.17～0.34 mg·g-1,生物可及性为6.38%～14.13%,结肠中总黄酮的生物可及性低于胃-小肠,这可能是因为胃-小肠的低pH值有利于铁皮石斛中黄酮类化合物的释放。铁皮石斛中总黄酮的生物可及性在TP6(云南玉溪)中较高,而在TP4(福建漳州)中较低,虽然TP6(云南玉溪)中的总黄酮含量较低,但其生物可及性高。在不同食品中酚类化合物的生物可及性已有报道,蔬菜、谷物和豆类的平均生物可及性分别为26.01%、28.00%和25.47%[21-22]。铁皮石斛作为一种药食同源的食物,经过胃-小肠-结肠消化后的总黄酮生物可及性为20.13%～34.62%,与蔬菜、谷物和豆类的生物可及性相当。

GID,胃-小肠消化液;CD,结肠消化液。

铁皮石斛中3种主要的黄酮单体化合物的生物可及性见表5。柚皮素、芦丁和夏佛塔苷经胃-小肠消化后的生物可及性分别为8.23%～18.37%、1.85%～22.87%和24.26%～42.65%,经结肠消化后的生物可及性分别为2.12%～5.67%、1.42%～5.70%和5.34%～13.33%。这3个黄酮单体在胃-小肠中的生物可及性都高于结肠中的生物可及性,这与总黄酮的生物可及性规律一致。柚皮素、芦丁和夏佛塔苷的生物可及性分别在TP9(云南德宏)、TP7(云南文山)和TP6(云南玉溪)中较高,而在TP3(广西巴马)、TP10(浙江乐清)和TP5(贵州赤水)中较低,与总黄酮的规律不一致,说明产地对黄酮单体生物可及性的影响与单体性质有关。夏佛塔苷的生物可及性大于柚皮素和芦丁,这可能是由于不同的黄酮单体在消化过程中的释放和代谢机制不同。芦丁虽然在铁皮石斛中的含量高,但其生物可及性较低,一方面可能是其与多糖相互作用,导致释放量减少[23],另一方面可能是芦丁在消化液中易降解,导致其在消化液中含量下降[24]。

表5 黄酮单体的生物可及性

2.4 铁皮石斛在体外消化过程中的抗氧化活性变化

图3显示了铁皮石斛的75%乙腈提取液、胃-小肠消化液和结肠消化液的抗氧化能力,其75%乙腈提取液的DPPH自由基清除能力为1 379.6～2 338.7 mg·kg-1,FRAP总抗氧化能力为3 723.7～6 392.6 mg·kg-1,胃-小肠消化液的DPPH自由基清除能力为1 336.8～2 111.1 mg·kg-1,FRAP总抗氧化能力为3 426.2～5 065.6 mg·kg-1,结肠消化液的DPPH自由基清除能力为322.6～1 322.3 mg·kg-1,FRAP总抗氧化能力为2 005.5～2 886.6 mg·kg-1。结果表明,铁皮石斛75%乙腈提取液的抗氧化活性>胃-小肠消化液的抗氧化活性>结肠消化液的抗氧化活性。对不同产地的铁皮石斛样品分析,从图3可以看出,TP9(云南德宏)的铁皮石斛在体外消化过程中的抗氧化能力较强,TP10(浙江乐清)中的抗氧化能力较弱。

DE,铁皮石斛提取液;GID,胃-小肠消化液;CD,结肠消化液。

对铁皮石斛黄酮类物质含量与抗氧化活性进行相关性分析,结果如表6所示:铁皮石斛中总黄酮、柚皮素、芦丁和夏佛塔苷的含量与DPPH自由基清除能力和FRAP总抗氧化能力的相关系数均大于0.7,黄酮类物质含量和抗氧化活性具有显著的正相关,说明黄酮类成分对于抗氧化能力具有重要作用,胃-小肠消化液的抗氧化活性高于结肠消化液的原因可能是胃-小肠消化液中黄酮类化合物的含量高。黄琴等[25]研究了铁皮石斛多酚和黄酮含量与抗氧化活性的相关性,结果表明,铁皮石斛中黄酮含量和抗氧化活性相关性较强,这与我们的研究一致。

3 结论

本研究利用固相萃取结合超高效色谱质谱联用技术,建立铁皮石斛中17种黄酮单体含量的测定方法。测定10批次铁皮石斛样品中的总黄酮和黄酮单体的含量,其中总黄酮含量为1.52～4.36 mg·g-1,柚皮素、芦丁和夏佛塔苷是铁皮石斛中含量较高的黄酮单体,其中芦丁含量在80%的样品中是最高的。通过对铁皮石斛样品进行模拟胃-小肠消化和结肠消化后,总黄酮的生物可及性分别为13.75%～21.45%和6.38%～14.13%,在胃-小肠中总黄酮的生物可及性要低于结肠中的生物可及性,柚皮素、芦丁和夏佛塔苷3种黄酮单体的生物可及性也有相近的规律。抗氧化活性测定结果表明,铁皮石斛75%乙腈提取液的抗氧化能力>胃-小肠消化液的抗氧化能力>结肠消化液的抗氧化能力,黄酮类物质含量和抗氧化活性具有显著的正相关。本研究将为铁皮石斛在医药、营养及功能性食品中的应用提供理论依据。