混菌发酵对两个品种葡萄酒香气的影响

李红玉，贺艳楠，李毅丽*

（1.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北昌黎 066600；2.河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050000；3.河北化工医药职业技术学院质量检测与管理系，河北石家庄 050000 ）

酿酒酵母是葡萄酒酒精发酵的主要微生物，而非酿酒酵母参与到发酵过程中，能够使葡萄酒产生多种酯类、醇类和酸类等复杂的风味化合物，并能提高酿酒酵母的代谢性能，从而对葡萄酒的色泽、香气及产品风格产生重要影响[1]。利用一些天然存在于葡萄中的具有优良酿酒特性的本土非酿酒酵母，与酿酒酵母同时参与到葡萄酒的酒精发酵过程中，有利于促进葡萄酒风味多样性的形成，塑造我国葡萄酒产区和地域典型性[2]。

混菌发酵不是两种微生物的简单混合，不同产区、不同的葡萄品种，所适合的非酿酒酵母、酿酒酵母与非酿酒酵母的混合比例与接种顺序具有很大差异，发酵后的葡萄酒品质也各有特色[3-4]。Prior等[5]将克鲁维毕赤酵母（P.kluyveri）和酿酒酵母（S.cerevisiae）混合接种，提高了葡萄酒中高级醇和乙基酯的含量；Renault等[6]将戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）用于混菌发酵，增强了葡萄酒中乙酯的含量；Anfang等[7]将P.kluyveri与S.cerevisiae以1∶9比例混合发酵，会使葡萄酒中果香硫醇的含量增加；杨诗妮等[8]将Torulaspora delbrueckii和S.cerevisiae以20∶1的比例顺序接种混合发酵，降低了葡萄酒中挥发酸的含量；还有研究表明，酿酒酵母和非酿酒酵母同时接种可增加葡萄酒乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等成分的含量，赋予葡萄酒更丰富的水果香气[9-10]。

东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）和葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）均为葡萄中广泛存在的非酿酒酵母。东方伊萨酵母不仅具有较好的耐热能力和耐酒精能力，而且高产乙醇和酯类物质，对于葡萄酒香气的形成具有重要贡献[11-12]。葡萄汁有孢汉逊酵母在发酵过程中具有较高的β-葡萄糖苷酶活性，这有利于果实中糖苷结合态香气成分的释放，增加葡萄酒的香气复杂度[13]。目前的研究更关注的是东方伊萨酵母[12]或葡萄汁有孢汉逊酵母[14]分别与酿酒酵母混合接种，而对于二者与酿酒酵母特别是国产安琪酵母的混和发酵对红葡萄酒品质影响的研究较为少见。

本研究利用课题组分离纯化的天然东方伊萨酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母两种菌株，在探索了混菌发酵对昌黎产区‘赤霞珠’葡萄酒品质影响的基础上，以怀来产区‘美乐’和‘赤霞珠’葡萄为原料，继续研究混菌发酵对葡萄酒香气成分的影响。通过检测不同样品的香气成分组成及含量，计算关键挥发性香气成分的OAV值，同时进行香气轮廓特征分析和主成分分析，充分探讨对怀来产区不同葡萄品种进行混菌发酵时，所采用的菌株及其比例不同时，分别呈现出的典型风格。这为国产酵母的应用及怀来产区葡萄酒特有产品特色的挖掘开辟新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄原料‘赤霞珠’和‘美乐’均于2021年9月25日采自河北怀来产区。‘赤霞珠’总糖含量为214.00 g·L-1，可滴定酸含量为5.63 g·L-1，pH为3.48；‘美乐’葡萄总糖含量为237.50 g·L-1，可滴定酸含量为5.63 g·L-1，pH为3.47。两品种卫生状况良好。

酵母菌株：东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）为河北科技大学饮料酒酿造研究室于2008、2009、2010年分别从河北省昌黎和沙城两个产区的葡萄园土壤、葡萄果实表面，以及‘赤霞珠’和‘龙眼’葡萄的自然发酵过程中分离、纯化的自选酵母菌。安琪酿酒酵母为商品酵母，购于安琪酵母股份有限公司。

试剂：葡萄糖、氢氧化钠、氯化钠、重亚硫酸钾（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；3-辛醇（色谱纯），美国Sigma-Aldrich公司；果胶酶，烟台帝伯仕自酿机有限公司；斐林试剂、次甲基蓝指示剂、酚酞指示剂等按照GB/T 603—2002进行配制。

1.2 仪器与设备

7820-5975 GC-MS联用仪，美国安捷伦公司；50/30 µm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取头、萃取手柄，美国Supelco公司；T09-1S恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；DHP-520电热恒温培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；雷磁pHS-3C pH计，上海仪电仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验处理

‘美乐’葡萄发酵组：接种安琪酿酒酵母的酒样（MA）为对照组；东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母以1∶1的比例同时接种发酵所得酒样（MIA）、葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母以1∶1的比例同时接种发酵所得酒样（MHA）为试验组。

‘赤霞珠’葡萄发酵组：接种安琪酿酒酵母的酒样（CA）为对照组；东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母以1∶1的比例同时接种（CIA）、有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母以1∶1的比例同时接种发酵（CHA）为试验组。

1.3.2 葡萄酒接种与发酵

将葡萄采收后经除梗、破碎、混匀，转入彻底灭菌的10 L玻璃发酵罐，加入偏重亚硫酸钾50 mg·L-1、果胶酶30 mg·L-1，混匀后静置过夜，以200 mg·L-1的总酵母用量按1.3.1中所述的酵母比例活化后同时接种，以25～27 ℃的温度进行发酵。残糖低于4 g·L-1后，结束酒精发酵，分离得到发酵原酒。之后，采用控温启动自然发酵的方式进行苹果酸-乳酸发酵，完成后加入50 mg·L-1SO2终止发酵并满罐密封贮存，静置1个月分离沉淀，陈酿3个月后对各发酵组取样进行检测。

1.3.3 理化指标检测

葡萄和葡萄酒中总糖、可滴定酸、pH等理化指标的测定参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.4 香气成分的检测

使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HSSPME-GC-MS）技术检测葡萄酒中的香气成分[15]。

香气成分的萃取：取2.0 g NaCl、5.0 mL酒样、及0.5 mL质量浓度为0.3 g·L-1的内标物3-辛醇，依次放入20 mL顶空瓶中，放入转子，插入萃取头，置于50 ℃水浴中以1000 r·min-1的转速平衡15 min，推出萃取头吸附30 min。进样时要在进样口解析3 min。每个样品做3个独立重复。

色谱条件的设置：Agilent J&W HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm）；载气为氦气（99.999 %），流速1.0 mL·min-1；升温程序：40 ℃保持12 min，以10 ℃·min-1的速率升至120 ℃后保持12 min，再以3 ℃·min-1升至250 ℃保持5 min；进样口温度250 ℃。MS条件：离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子电离源，电子能量70 eV；质量扫描范围45～550 u。

香气成分的定性分析：提取香气成分质谱图，与NIST质谱数据库进行比对检索，并参考C8～C20烷烃混合标准品的保留时间，用保留指数法（Retention Index，RI）对香气成分进行定性分析。

香气成分的定量分析[16]：采用内标半定量法进行定量分析，即根据内标物与样品中各香气成分的峰面积比值，计算待测成分的相对浓度，见公式（1）：

式中：C1为待测成分的质量浓度，μg·mL-1；f为相对校正因子，f=1；A1为待测成分的峰面积；A0为内标物3-辛醇的峰面积；C0为内标3-辛醇的质量浓度，μg·mL-1；V0为加入内标3-辛醇的体积，mL；V1为测定酒样的体积，mL。

1.4 数据统计分析

试验数据通过Excel 2019、Origin 2018进行汇总与统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品香气成分分析

葡萄酒中的香气成分主要由醇类、酯类、酸类和醛酮类等物质构成。对发酵酒样进行香气成分分析，如表1所示，所有样品共检测出香气成分77种，其中包括酯类21种，醇类12种，酸类8种，醛酮类4种，萜烯类10种及其它化合物22种。

表1 酒样中香气成分种类及含量Table 1 Types and contents of aroma compounds in wine samples

在香气物质方面，CHA含量最高，为53 243.98 µg·L-1，其次是MHA含量，为44 050.57 µg·L-1，分别比对照CA组和MA组提高48.40%和51.42%。

2.1.1 酯类组分比较

酯类化合物是葡萄酒的典型香气成分，大多数具有鲜花或水果的香气，主要形成于酒精发酵过程和葡萄酒的陈酿过程[17]。‘美乐’样品中，MIA组酯类物质在所有样品中是最多的，为14种，含量比MA组提高了96.90%；而‘赤霞珠’葡萄发酵组中CIA和CHA中酯类成分种类和含量均低于对照组。

发酵后样品中共有且含量最高的酯类成分是乙酸乙酯。乙酸乙酯是葡萄酒中最主要的酯类物质之一，具有典型的水果香味。MIA中乙酸乙酯含量最多，比对照组增加123.49%。发酵后样品中共有的酯类还有辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯和正己酸乙酯，MHA和CHA中辛酸乙酯、癸酸乙酯含量均高于对照组。

2.1.2 醇类组分比较

醇类主要是酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物，是葡萄酒发酵香气的最主要成分[16]。由图1可知，发酵样品中醇类物质的总含量为16 071.17～40 215.65 µg·L-1，能够赋予葡萄酒复杂、浓郁的香气。MHA和CHA组醇类的总含量最高，为香气物质总含量的74.09%和75.53%，所有醇类中苯乙醇含量最高，分别比对照组增加107.10%和107.30%，占样品中高级醇总含量的99.44%和99.63%；而MIA和CIA组醇类含量虽低于MHA和CHA组，但种类增加。

图1 酒样中各类香气物质的比例Figure 1 The proportions of various classes of aroma substances in wine samples

2.1.3 酸类组分比较

发酵样品中的酸类物质包括乙酸、己酸、异丁酸等8种，其中MIA组中种类最多，含量也最高。样品中共有的酸类组分有己酸、辛酸、癸酸。辛酸作为C8～C10的低级脂肪酸，含量大于20 mg·L-1时具有不良风味，低含量时具有干酪味和粗犷味，能够抑制芳香酶的水解，维持葡萄酒的香气平衡。辛酸含量为333.37～1199.34 µg·L-1，其中CHA中含量最多，这会对葡萄酒整体香气产生良好作用。

2.2 关键挥发性香气成分的OAV

为了更准确地区别不同酒样中挥发性香气成分的差异，查找相关香气成分的阈值，计算得到OAV值[18]。表2中显示，OAV值大于1的香气物质有13种，这些香气成分对酒样整体香气有重要贡献，是组成葡萄酒典型香气特征的主要成分，其中含量最多的是酯类，是酒样中特征香气物质。样品MHA和CHA中酯类物质的OAV值分别增加216.82%和169.91%，表明葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵对于提高酯类的OAV值效果显著。

表2 不同处理葡萄酒中的挥发性物质的OAV（OAV＞1）Table 2 OAV Volues of volatile compounds in the wines obtained by different treatments (OAV＞1)

2.3 关键挥发性香气成分的香气轮廓特征分析

香气物质的感官属性可通过香韵（香气特征类型）和香势（香气活度）来描述，这是评价香气物质香气质和香气量的重要参数[19]。葡萄酒中香气物质按照其气味特征可分为9种香韵类型[20]：1-果香，2-花香，3-植物味，4-坚果香，5-焦糖味，6-土腥味，7-化学味，8-脂肪味，9-烘烤味。计算各组酒样中OAV大于1的香气物质的总和，分别归入果香、花香、脂肪味、焦糖味、化学味、植物味6种香气类型。

由图2可知，MA和CA样品中果香、花香、植物味、脂肪味较为突出，经过混菌发酵，酒样中脂肪味显著增加，香韵结构比例发生变化，香韵次序调整为果香＞脂肪味＞花香＞植物味＞化学味＞焦糖味，这有利于赋予葡萄酒更为丰富的发酵香。其中，MHA和CHA样品中果香和脂肪味的香气量大幅增加，成为整体香气的主要贡献者。

图2 两个品种不同处理的葡萄酒样品感官香气轮廓图Figure 2 Sensory aroma profile of different treaments of two sample wines

2.4 关键挥发性香气成分的主成分分析

对所有OAV大于1的13种挥发性香气成分进行PCA分析结果如图3（其中得分图是对每个样品的三组平行试验结果进行的分析，分别标注为1，2，3）所示，PC1、PC2和PC3占数据总体方差的42.1%、30.5%和12.9%，总贡献率为85.5%。MHA和CHA组，主要位于PC1的正方向上，香气特征物质为苯乙醇、正己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸等，葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酵母混合发酵，对发酵酒样中香气成分含量影响较大。CIA与CA接近，MIA与MA在PC1和PC2的方向较为接近，说明东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母混合发酵对香气成分含量的影响不明显。

图3 样品中OAV大于 1 的香气成分主成分分析的得分图和载荷图Figure 3 Principal component analysis (PCA) for aroma compounds (OAV＞1) in samples

3 讨论与结论

在葡萄酒的发酵过程中，酵母形成一个复杂的体系，不同种群之间进行着竞争作用或其他相互作用。有研究表明，与单一菌株发酵的葡萄酒相比，有效利用非酿酒酵母与酿酒酵母的相互作用，可以显著增加葡萄酒感官质量的复杂性[13]。目前的研究大多集中在分析不同来源、不同种类的非酿酒酵母的增香特性方面[21]。

本文利用从葡萄生长环境中分离所得东方伊萨酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母两株非酿酒酵母与国产酿酒酵母菌株进行混合发酵发现，东方伊萨酵母参与葡萄酒酒精发酵，能增加‘美乐’葡萄酒中酯类、醇类和酸类成分的种类；葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母混菌发酵，显著地提高‘美乐’和‘赤霞珠’葡萄酒中香气成分的含量，特别是醇类物质增加明显。由此可知，非酿酒酵母可赋予葡萄酒丰富的花香和果香，但非酿酒酵母种类不同，葡萄品种不同，混菌发酵所得的葡萄酒品质有很大差异。试验证实非酿酒酵母促进了‘美乐’葡萄酒中酯类成分种类和含量的增加，促进了‘赤霞珠’葡萄酒中辛酸乙酯、癸酸乙酯的生成，这两种中链脂肪酸乙酯在葡萄酒中起到协同增香的作用[22]。与东方伊萨酵母相比，葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母的混合发酵，更有利于增加醇类，特别是苯乙醇的含量，由于苯乙醇是发酵样品中共有的高级醇，也是葡萄酒中最典型的醇类成分，能够赋予葡萄酒蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人的香味[23]，因此能够显著提高‘美乐’葡萄酒中香气复杂性。相比而言，东方伊萨酵母可显著增加葡萄酒中的乙酸、己酸、异丁酸等酸类物质的种类和含量，这些酸类物质主要为有机酸，来源于发酵副产物和葡萄浆果，对于保持酒体平衡和口感清爽具有重要作用。

本试验主要探讨了东方伊萨酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母分别与安琪酿酒酵母以1∶1的比例同时接种发酵对葡萄酒香气成分的影响，后续会进一步探索接种比例及接种顺序对不同品种葡萄酒的影响，为推动混菌发酵在实际生产中广泛应用奠定理论基础。