一株拜耳接合酵母菌的基本性能及发酵香气研究

汤晓宏，丁燕，钟轲，荆晓姝，韩晓梅，李志宇，杨阳，孙玉霞*

（山东省葡萄研究院/山东省酿酒葡萄与葡萄酒技术创新中心，山东济南 250100）

在食品产业中，拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）被普遍认为是一株腐败酵母，能够导致蛋黄酱、沙拉酱、调味汁和葡萄酒等食品的腐败，给食品企业造成巨大经济损失。Z.bailii之所以能成为腐败酵母，是由于其对各种胁迫环境的特殊耐受性，特别是对弱酸的显著耐受性，而弱酸常被用作食品防腐剂，例如：乙酸、苯甲酸、丙酸、山梨酸和二氧化硫。尽管早期Z.bailii被认为是食品中的有害微生物，但近年来研究表明，Z.bailii作为食品发酵的微生物具有潜在的生物学价值[1-2]，如它对葡萄酒组成和风味形成有积极贡献。Zuehlke等[3]对几株拜尔接合酵母进行研究发现，在‘赤霞珠’葡萄酒的酒精含量13%时，Z.bailiiB2能去除酒中残留的果糖（果糖＞60%），达到发酵干型葡萄酒的目的。Escribano-Viana等[4]研究了几株非酿酒酵母与酿酒酵母混菌发酵对‘丹魄’葡萄酒的影响，结果发现，Z.bailii不仅能改善单体花青素组成，还能提高二苯乙烯的含量，提升葡萄酒品质。Garavaglia等[5]研究了Z.bailiiBCV 08混菌发酵对葡萄酒香气品质的影响，结果发现，在所有含有Z.bailiiBCV 08的试验中，乙酯类香气化合物的含量均比对照有所增加。

混菌通常包括酿酒酵母菌和非酿酒酵母菌，通过混菌发酵，能够丰富葡萄酒中的香气成分，增加香气的层次感，因此近些年的研究较多[6-8]。葡萄中富含葡萄糖和果糖，混菌发酵中的微生物优先转化利用葡萄糖，其次是果糖，导致酒精发酵周期延长[9]。另外，混菌中的微生物竞争激烈，在碳源丰富时期，优势菌在整个发酵过程中大量繁殖，而劣势菌可能自始至终都难以发挥预期的作用，从而导致同时期的葡萄酒品质产生差异[10]。因此，提供一种既能在发酵过程中减少混菌竞争、又能改善葡萄酒香气的微生物在葡萄酒酿造中具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

‘小芒森’葡萄：2021年10月取自蓬莱，可溶性固形物25.6 %，总酸5.6 g·L-1，pH 3.56。

拜耳接合酵母（Z.bailii）JDCD01保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M2022204；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EC1118：烟台帝伯仕自酿机有限公司。

①YPD液体培养基（葡萄糖培养基）：酵母浸粉10 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，自然pH；

②自制果糖培养基：在YPD液体培养基的基础上略作改动，将20 g·L-1的葡萄糖改为果糖20 g·L-1，其它不变；

③自制双糖培养基：在YPD液体培养基的基础上略作改动，将20 g·L-1的葡萄糖改为葡萄糖10 g·L-1，果糖10 g·L-1，其它不变；

④模拟葡萄汁（M4241D）：葡萄糖100 g·L-1，果糖100 g·L-1，酒石酸3 g·L-1，柠檬酸0.3 g·L-1，L-苹果酸为0.3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，(NH4)2SO40.3 g·L-1，天冬酰胺0.6 g·L-1，MnSO4·H2O 4 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 4 mg·L-1，CuSO4·5H2O 1 mg·L-1，KI 1 mg·L-1，H3BO31 mg·L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1 mg·L-1，CoCl2·6H2O 4 mg·L-1，肌醇0.3 g·L-1，生物素0.04 mg·L-1，维生素B11 mg·L-1，维生素B61 mg·L-1，烟酸为1 mg·L-1，泛酸1 mg·L-1，对氨基苯甲酸1 mg·L-1，购自山东拓扑生物工程有限公司。

发酵液制备：‘小芒森’除梗破碎，压榨取汁，室温8000 r·min-1离心5 min，先经0.8 µm滤膜过滤后，再用0.45 µm无菌滤膜过滤，备用。

1.2 仪器和设备

DXL100A全自动高压蒸汽灭菌器（山东德祥仪器有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5810R冷冻离心机（德国）；Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪（Hi-Plex H型色谱柱：300×7.7 mm），7890A-5977B型GC-MS联用仪（DB-WAX型色谱柱：60 m×0.32 mm×0.25 μm），美国Agilent公司；DVB/CAR/PDMS型萃取头（50/30 μm），美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 JDCD01生长曲线及其对应酶活

菌种的活化：取1环JDCD01加入YPD液体培养基中，在28 ℃、200 r·min-1条件下震荡培养24 h，然后20 ℃、8000 r·min-1离心5 min，收集新鲜菌体。

接种培养：称取0.25 g新鲜的JDCD01，加至100 mL YPD液体培养基中，第1组在28 ℃、200 r·min-1条件下震荡培养，第2组置于28 ℃恒温培养箱中静置培养，每组3个重复。

生长曲线：分别在0、4、8、12、16、20、24、32、48、72、96、120 h对第1组取样，测定菌悬液在600 nm波长处的吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。

酶活曲线：分别在接种后的24、32、48、72、96、120 h对第1组和第2组进行取样，测定β-葡萄糖苷酶活性，以培养时间为横坐标，酶活为纵坐标，绘制累计酶活[11]曲线。

1.3.2 JDCD01对葡萄糖、果糖的利用

用1 μL接种环取1环活化后的JDCD01、EC1118（对照）分别接种于不同糖源组成的①～④号培养基中，每隔2 d取样1次，采用HPLC法测定葡萄糖和果糖组成。

1.3.3 JDCD01对酿造环境的耐受性

以EC1118为对照，用1 μL接种环取一环JDCD01分别接种于葡萄糖和果糖质量浓度均为（10%、20%、30%、40%）、酒精梯度（6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，Vol）、pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、渗透压（以KCl浓度计，0.8、1.0、2.4、2.6、2.8 mol·L-1）、SO2质量浓度（100、150、200、250、300、350、400、500 mg·L-1）、温度（11、12、13、38、39、47、48 ℃）的装有5 mL YPD液体培养基的带杜氏管的试管中，28 ℃恒温培养1周，观察其生长状况。

1.3.4 JDCD01的发酵特性研究

取1环斜面JDCD01，接种于YPD液体培养基中，28 ℃ 200 r·min-1摇床培养24 h收集菌体，无菌水清洗3次，备用。每瓶（800 mL）灭菌‘小芒森’葡萄汁接种0.5 g鲜菌体，接种浓度约为107cfu·mL-1；顺序发酵组先接种0.25 g JDCD01鲜菌体，20 ℃条件下发酵48 h后，再接种0.25 g EC1118鲜菌体；所有发酵组合都在20 ℃条件下进行，发酵过程中每天测定CO2损失量[12]，直到相邻两次失重差小于0.2 g。结束发酵，存于-20 ℃冰箱，取样测葡萄酒理化指标及香气组成，以EC1118为对照。

1.3.5 高效液相色谱仪测葡萄糖/果糖组成

高效液相色谱工作条件：色谱柱为Hi-Plex H，300 mm×7.7 mm；流动相为0.05 mol·L-1硫酸溶液，流量0.6 mL·min-1；柱温70 ℃；示差检测器，检测温度30 ℃，进样量20 μL。

外标法定量：分别精密称取200.00 mg的葡萄糖和果糖于10 mL容量瓶中，超纯水定容，即得20 g·L-1的混标溶液，按一定浓度作梯度稀释，制作标准曲线。

1.3.6 香气分析

取8 mL 1.3.4中发酵结束的葡萄酒样品，加入1.5 g NaCl和20 μL 2.00 g·L-1的4-甲基-2-戊醇（内标）于15 mL顶空瓶中，45 ℃预热10 min，然后萃取50 min，萃取过程中顶空瓶在搅拌器中连续振荡，进样口250 ℃解析10 min。

程序升温：初温40 ℃，以1 ℃·min-1升至45 ℃，保持2 min；以3 ℃·min-1升至84 ℃，保持2 min；然后以3 ℃·min-1升至120 ℃，保持3 min；以3 ℃·min-1升至200 ℃，再保持3 min；以5 ℃·min-1升至230 ℃，也保持3 min。进样器温度250 ℃；检测器温度25 ℃，不分流进样，恒流模式，流速0.8 mL·min-1。

MS条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量为70 eV；离子源温度 200 ℃；接口温度 250 ℃；全扫描模式，质量扫描范围35～450 amu。

定性分析：将MS图运用计算机谱库（NIST14/NIST20）进行初步检索和分析，再结合相关文献资料对人工谱图进行解析，确定挥发性物质的各个化学成分。定量分析：采用内标法半定量分析，计算样品中各香气组分的含量。

1.3.7 感官分析

参照Martínez-Gil等[13]的方法，再结合国标（GB 15037—2006）中葡萄酒感官分级评价描述。邀请8名国家级的品酒师，分别从外观、香气、滋味、典型性等方面对酒样进行感官品评。品评结果以10分制计，从0到10分依次代表感官逐渐增强。根据定量描述结果绘制葡萄酒感官分析雷达图。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，多组间比较采用One-Way ANOVA法，作图采用Excel 2007软件。

2 结果与分析

2.1 JDCD01生长曲线及其对应酶活

由图1可知，拜耳接合酵母JDCD01在振荡培养48 h左右生长曲线达到平衡期，开始迅速积累次级代谢产物，120 h摇床培养累计酶活高达116.8 U·L-1，β-葡萄糖苷酶酶活受氧气影响较大，静止与摇床培养120 h累计酶活相差68.1 U·L-1。

图1 JDCD01生长曲线及其β-葡萄糖苷酶累计酶活Figure 1 Growth curve of JDCD01 and corresponding enzyme activity

2.2 JDCD01对葡萄糖、果糖的利用

不管是葡萄糖或果糖单独存在，还是二者同时存在的情况下，拜耳接合酵母JDCD01对果糖的代谢速率都快于葡萄糖，而EC1118对果糖和葡萄糖的代谢速率与之相反（图2、3、4）；也就是说，拜耳接合酵母JDCD01和EC1118对果糖和葡萄糖利用的优先顺序上不同，因此，在葡萄酒发酵中，可以将JDCD01和EC1118混合发酵，以减少菌株对碳源的竞争。

图2 在单一糖源培养基中JDCD01对糖的利用Figure 2 Utilization of sugar by JDCD01 in a single glycogen medium

图3 在双糖源培养基中 JDCD01对糖的利用Figure 3 Utilization of sugar by JDCD01 in disglycogen medium

图4 模拟葡萄汁中JDCD01对葡萄糖和果糖的利用Figure 4 Metabolism of glucose or fructose by JDCD01 under fermentation conditions

2.3 JDCD01对酿造环境的耐受性

由表1可知，经试验观察菌株JDCD01对SO2、葡萄糖、果糖和pH的耐受性与EC1118相当，耐受能力较强，具有一定潜力。JDCD01对酒精、渗透压和低温的耐受性略低于EC1118。虽然JDCD01在低温10 ℃不生长，但将其放回室温仍能生长，说明此条件下只是抑制了它的生长，并未使其失活。

表1 JDCD01对酿造环境的耐受性Table 1 Brewing environment tolerance of JDCD01

2.4 JDCD01的发酵特性研究

在发酵过程中，碳水化合物代谢会产生乙醇、CO2和多种副产品。发酵过程的失重是CO2释放的结果。由图5可知，在前两周内，EC1118释放的CO2最多，发酵速率最快；JDCD01释放的CO2最少，发酵速率最慢；混菌发酵释放CO2的能力与EC1118接近。

图5 混菌发酵过程中CO2累计失重变化Figure 5 Changes of CO2 accumulated weight loss in the mixed fermentation process

由表2可知，用JDCD01发酵的葡萄酒在发酵结束时（相邻两次CO2失重差小于0.2 g），葡萄糖剩余量为22.67 g·L-1，EC1118、JDCD01+EC1118组均发酵比较彻底。混菌发酵组不仅能够提高甘油产量，乙醇产量也更高一些，且能降低乙酸含量。

表2 不同菌株发酵的葡萄酒理化指标Table 2 Physicochemical indexes of wine fermented by different strains

通过GC-MS分析，3组发酵样品中都检测到了醇类、酮类、酸类、酯类、苯环类和萜烯类等香气组分。对照组EC1118检测出31种香气成分，总含量为152.03 mg·L-1；拜耳接合酵母JDCD01共检测出31种香气成分，总含量为155.87 mg·L-1；EC1118和JDCD01混菌发酵共检测出32种香气成分，总含量为143.32 mg·L-1，JDCD01 16 500 400 400 2.5 2.6 12 EC1118 18 500 400 400 2.5 2.8 10具体香气组成见表3。

表3 不同菌株发酵的葡萄酒香气成分Table 3 Aroma composition of wine fermented by different strains mg·L-1

从表3可以看出，JDCD01纯种发酵和两种酵母顺序接种的发酵萜烯类香气含量略高于对照组。JDCD01纯种发酵的葡萄酒苯乙醇、2,3-丁二醇、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯等香气成分的含量更为丰富；EC1118纯种发酵的葡萄酒酯类化合物略高，特别是癸酸乙酯的含量高达23.11 mg·L-1；两种酵母顺序接种的辛酸、乙酸苯乙酯、香茅醇和大马士酮高于纯种发酵组。

2.5 主成分分析

对不同发酵组合酒样的所有香气成分进行主成分分析，3种组合发酵方式的香气成分（含量大于阈值，即OAV＞1）差异及分布情况如图6所示。

图6 葡萄酒样品中挥发性有机物的PCA图Figure 6 PCA diagram of volatile compounds in wine

由图6可知，PCA分析中3个平行样品大致能聚到一起，说明试验平行效果良好。添加不同酵母组合的发酵样品都分布在不同的项限，说明不同组合之间差异明显。PC1和PC2的方差贡献率分别为40.53%和31.39%。提取出的前两个主成分对整体方差的累计贡献率达到71.92%，表明这两个主成分可代表酒样挥发性香气物质的主要特征。JDCD01分布在第1项限，对应特征香气成分为苯乙醇、辛酸乙酯、己酸乙酯、9-癸烯酸乙酯和乙酸异戊酯；EC1118在第一主成分的负半轴，对应特征香气成分为癸酸乙酯、异戊醇、香茅醇、己酸和辛酸；JDCD01和EC1118顺序接种发酵分布在第4项限，对应特征香气成分为大马士酮和乙酸苯乙酯。

2.6 感官分析

采用定量描述分析法对不同接种方式的葡萄酒样品进行感官评价。由8位评委分别从：视觉（色泽、澄清度），香气（浓郁度、花香、果香、酒香），滋味（甜味、酸味、酒体饱满度、平衡感、持久性）和典型性等11个属性对不同组合方式发酵的葡萄酒样品进行品评，根据定量描述结果做感官分析雷达图，如图7所示。

图7 葡萄酒酒感官分析雷达图Figure 7 Radar map of sensory analysis for wine

从外观方面来看，JDCD01和EC1118共同发酵组的葡萄酒样品更澄清，色泽更鲜亮。从香气角度分析，JDCD01和EC1118共同发酵的葡萄酒样品花香更突出；EC1118发酵的果香更突出，但也略低于顺序接种发酵组；JDCD01单独发酵表现出更多的焦糖甜香。从风味角度分析，JDCD01和EC1118顺序发酵葡萄酒样品酸度适中，口感更加柔顺、酒体更饱满，其次是EC1118单独发酵的葡萄酒，JDCD01单独发酵的葡萄酒酸度更突出。总体来看，JDCD01和EC1118顺序接种发酵有利于提高葡萄酒香气品质。

3 讨论与结论

混菌发酵中的微生物竞争激烈，葡萄糖、果糖等底物不同会引起代谢产物的差异。有研究发现，相较于葡萄糖而言，拜耳接合酵母更倾向于利用果糖[5,18]，这与本研究结果一致。不管葡萄糖或果糖单独存在还是同时存在的情况下，拜耳接合酵母JDCD01对果糖的代谢速率均快于葡萄糖，这与酿酒酵母EC1118相反。因此，在葡萄酒发酵中，可以将JDCD01和EC1118混合发酵，以减少菌株对碳源的竞争。

非酿酒酵母主要在葡萄酒浸渍和发酵初期发挥作用，相对于酿酒酵母，非酿酒酵母各方面的耐受能力都低于酿酒酵母。刘宜睿等[19]从桑葚自然发酵汁和桑葚果表皮中分离纯化出的4株产香非酿酒酵母耐酒精能力为9%，远低于本试验JDCD01的耐受性；刘灿珍等[20]研究发现，戴尔有孢圆酵母对乙醇的耐受浓度为18%，对SO2和葡萄糖的耐受性分别为420 mg·L-1和500 g·L-1，对SO2的耐受性远低于本试验中JDCD01的耐受性，说明不同酵母间耐受性差异较大；董琦楠等[21]研究发现，非酿酒酵母菌株LT1能耐受酒精度为12%、耐受糖浓度为400 g·L-1及pH最低2.75；庄孝杰等[22]通过试验获取了一株性状优良的Z.bailii15，可耐受pH 2.0和37 ℃高温及8%酒精度，较模式株更适应酿造环境。本研究筛选的非酿酒酵母JDCD01的酒精耐受性为16%，葡萄糖和果糖耐受性均为400 g·L-1，KCl耐受性为2.6 mol·L-1，SO2耐受性为500 mg·L-1，pH耐受性为2.5～4.5，温度耐受范围为12～48 ℃，适应葡萄酒酿造环境。

Z.bailii作为食品发酵微生物具有潜在的生物学价值，例如它能产生乙酯类化合物，对葡萄酒风味形成有积极贡献。Ciani等[23]研究发现，Z.bailii产生高水平的乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯和乙酸乙酯，这与本试验结果一致，不管是JDCD01纯种发酵还是与EC1118混合发酵，这3种物质的含量都增加。此外，本试验的拜耳接合酵母JDCD01还能提高萜烯类化合物和苯乙醇的含量。萜烯类化合物是一类具有特殊芳香气味的化合物，且阈值很低，容易被感知，可以提高葡萄酒香气品质。苯乙醇是葡萄中苯丙酸代谢的衍生物，它拥有玫瑰般的清甜香气[24-25]。Cioch-Skoneczny等[26]研究了不同酵母组合发酵，以改善冷气候条件下葡萄酒香气，结果发现Z.bailii749产苯乙醇能力很低，它与S.cerevisiaeMH020215不同比例混合发酵能明显提升苯乙醇含量。在本试验中，JDCD01菌株发酵液中苯乙醇含量最高，达到22.47 mg·L-1；其次为混菌发酵，最低的是EC1118纯种发酵。混菌发酵和JDCD01纯种发酵，苯乙醇的含量分别是EC1118的1.28倍和1.48倍。由此可见，混菌发酵和JDCD01纯种发酵有利于突出玫瑰清甜香气特征。

综上所述，JDCD01的耐受性指标如下：酒精16%，葡萄糖400 g·L-1，果糖400 g·L-1，KCl 2.6 mol·L-1，SO2500 mg·L-1，pH 2.5～4.5，温度12～48 ℃，适应葡萄酒酿造环境。在混菌发酵过程中，JDCD01能优先利用果糖，减少混菌发酵过程中对糖源的竞争，使菌株能够充分发挥各自的性能。不管是纯种发酵还是顺序接种发酵，JDCD01均提高了葡萄酒中苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等香气成分的含量，丰富了葡萄酒的香气。