三种方法提取毛霉菌核酸效能的比较实验研究

潘永圣，蒲 丹，汪佳婕，赵云平，徐宏忍，白敏凤，许小靓，尹利民

（昆明市第一人民医院检验科，昆明 650011）

毛霉菌是临床上常见侵袭性真菌疾病（毛霉菌病）的病原菌，人类主要通过吸入真菌孢子囊、摄入被污染的食物或皮肤创伤而获得感染[1]。实体器官或造血干细胞移植患者、血液系统恶性肿瘤患者、未被控制的糖尿病和/或伴有酮症酸中毒患者等免疫功能低下患者毛霉菌感染的发生率较高[2]。毛霉菌可侵入宿主血管，导致血栓形成和组织坏死，但其感染后无特异性症状、临床表征和影像学表现不明显，进展迅速，具有较高的发病率和病死率[3]。因此，在该菌感染早期就能快速准确诊断和治疗将有助于降低患者病死率。虽然目前毛霉菌确诊主要依赖于组织病理学和真菌培养，但其周期长、阳性率低、敏感性低等因素，无法满足对其快速准确鉴定的要求[4]。近年来，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术凭灵敏度高、特异度强及操作简便迅速等优点在真菌鉴定、分型和耐药性分析中发挥着越来越重要的作用。PCR技术可以早期检测培养物、组织、血液和尿液等不同样本类型中的毛霉菌[5-7]。提取核酸模板是PCR检测的关键步骤之一，而核酸模板质量是决定PCR法检测结果灵敏度和可信度的关键因素，因此获得高质量的核酸模板对于开展PCR检测工作十分重要[8]。回顾近几年研究发现国内关于毛霉菌PCR检测技术和核酸模板提取方法研究的相关报道不多，因此本研究探索改良碱裂解法、一步法及磁珠法提取毛霉菌核酸效能的差异，以及探索一种快速、简便、经济的毛霉菌核酸提取方法，为临床应用PCR技术快速高效检测毛霉菌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选用米黑根毛霉（Rhizomucormiehei，R.miehei）、伞枝犁头霉（Lichtheimiacorymbifera，L.corymbifera）和卷枝毛霉（Mucorcircinelloides，M.circinelloides）3株毛霉菌标准菌株为研究对象，以上标准菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。本研究已通过昆明市第一人民医院医学伦理委员会审查批准。

1.2 仪器和试剂 主要仪器设备：全自动核酸提取仪（GeneRotex 96，西安天隆科技有限公司），核酸浓度测定仪（Qbit4，赛默飞世尔科技有限公司），实时荧光定量PCR扩增仪（SLAN-96P，上海宏石医疗科技有限公司）。主要试剂：一步法检测试剂（Lysis buffer for microorganism to direct PCR 9164，Takara Bio公司）；磁珠法检测试剂（西安天隆科技有限公司）；马铃薯葡萄糖水、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和琼脂（昆明鼎国生物科技有限公司）；氢氧化钠（NaOH）、Tris-HCl[生工生物工程（上海）股份有限公司]；2×PCR预混液[SGExcel GoldStar TaqMan Master，包含GoldStar Taq DNA Polymerase，PCR Buffer，dNTPs和Mg2+。生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 毛霉菌标准菌株培养和菌液制备：将R.miehei和L.corymbifera菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）上培养48h（其中R.miehei置于45℃下培养，L.corymbifera置于25℃下培养），将M.circinelloides菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD培养基）上25℃培养48h。分别挑取上述培养的菌落，加入已称重的含3ml灭菌等渗氯化钠溶液试管中，再次称重调整使每管含毛霉菌150mg，振荡混匀后均匀分为15管（每种毛霉菌每种提取方法各5管），每管含毛霉菌约10mg，13 000r/min离心5min弃上清液，备用。

1.3.2 改良碱裂解法[9]：向上述备用菌中加入80μl的0.5mol/L NaOH，涡旋振荡混匀1min，加入160μl 0.1 mol/L Tris-HCl中和，再次涡旋振荡混匀1min，4℃13 000r/min离心5min，取上清于-20℃保存备用。

1.3.3 一步法：在上述备用菌中加入50μl样本释放剂，涡旋振荡混匀1min，85℃热变性20min，4℃13 000r/min离心5min，取上清于-20℃保存备用。

1.3.4 磁珠法：于上述备用菌中加入180μl溶菌酶溶液和20μl蛋白酶K溶液，涡旋振荡混匀后50℃加热30min，再加入200μl菌体消化液，涡旋振荡混匀，将上述液体加入到试剂盒中，上机提取，40min 后获得核酸提取物。

1.3.5 毛霉菌菌株核酸浓度测定：用Qbit4核酸浓度测定仪测定上述不同提取方法提取核酸的浓度，具体操作严格按照操作说明进行。

1.3.6 引物和探针合成：根据MILLON等[7]报道合成R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides扩增引物和探针：RM-F：5’-CACCGCCCGTCGCTAC-3’，RM-R：5’-GTAGTTTGCCATAGTTCGGCTA-3’和RM-P：5’-TTGAATGGCTATAGTGAGCATATGGG AGGCT-3’；LC-F：5’-CACCGCCCGTCGCTAC-3’，LC-R：5’-GCAAAGCGTTCCGAAGGACA-3’和LC-P：5’-ATGGCACGAGCAAGCATTAGGGACG-3’；MC-F：5’-CACCGCCCGTCGCTAC-3’，MC-R：5’-CCTAGTTTGCCATAGTTCTCAGCAG-3’和MC-P：5’-CCGATTGAATGGTTATAGTGAGCA TATGGGATC-3’。R.miehei探针的5’端以HEX报告荧光基团标记，3’端以BHQ1淬灭基团标记；L.corymbifera探针的5’端以ROX报告荧光基团标记，3’端以BHQ1淬灭基团标记；M.circinelloides探针的5’端以CY5报告荧光基团标记，3’端以BHQ1淬灭基团标记。以上引物和探针委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.7 实时荧光定量PCR扩增实验：在PCR管中依次加入25μl 2×PCR预混液，各引物和探针1μl（终浓度为0.2μmol/L），核酸模板5μl，以RNase-Free ddH2O补足体系至50μl。PCR反应条件：95℃10min，循环1次，95℃变性15s，60℃退火/延伸60s，循环40次。荧光信号收集设在60℃。Ct值＜38且曲线呈S型判断为阳性。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 统计软件进行数据分析，计量资料服从正态分布的采用均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种提取方法所得核酸浓度和优缺点比较 见表1。改良碱裂解法、一步法及磁珠法均能提取出R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides三株毛霉菌核酸，各种方法提取毛霉菌核酸浓度由高到低分别为：一步法＞改良碱裂解法＞磁珠法（P＜0.05），一步法和改良碱裂解法两种直接裂解法差异有统计学意义（t=4.876，15.884，17.213，均P＜0.05）。改良碱裂解法提取毛霉菌核酸所需时间最短，一步法次之，磁珠法最长，差异有统计学意义（F=2 574.074，P＜0.001）。各种方法提取毛霉菌核酸的耗费成本和设备依赖度由高至低依次为：磁珠法＞一步法＞改良碱裂解法。

表1 三种提取方法提取3株毛霉菌核酸结果比较（±s，n =5）

类 别改良碱裂解法一步法磁珠法FP耗费时间（min）10.00±1.5025.00±1.5075.00±1.502 574.074＜0.001 DNA提取浓度（ng/μl）R.miehei0.58±0.061.20±0.280.25±0.0938.803＜0.001 L.corymbifera5.92±0.298.17±0.130.76±0.022 160.759＜0.001 M.circinelloides1.18±0.165.82±0.580.65±0.10325.175＜0.001

2.2 三种提取方法提取毛霉菌核酸产物实时荧光定量PCR实验结果 见表2。三种方法提取毛霉菌核酸产物实时荧光定量PCR扩增后均能扩增出阳性结果。对R.miehei菌株样本，改良碱裂解法和磁珠法提取的核酸产物扩增后的Ct值差异无统计学意义（t=1.114，P=0.298），一步法提取的核酸产物扩增后的Ct值小于另外2种方法，差异有统计学意义（t=5.852，5.277，均P＜0.05）。对L.corymbifera菌株样本，改良碱裂解法提取的核酸产物扩增后的Ct值小于一步法，相差5.00±0.125，差异有统计学意义（t=40.031，P＜0.001），磁珠法提取的核酸产物扩增后的Ct值小于另外2种方法，差异有统计学意义（t=27.953，60.265，均P＜0.05）。对M.circinelloides菌株样本，改良碱裂解法提取的核酸产物扩增后的Ct值大于另外2种方法，差异有统计学意义（t=3.372，4.106，均P＜0.05），一步法和磁珠法提取的核酸产物扩增后的Ct值差异无统计学意义（t=1.866，P=0.099）。

表2 3 种提取方法提取毛霉菌核酸实时荧光定量PCR检测法Ct值比较（±s，n =5）

表2 3 种提取方法提取毛霉菌核酸实时荧光定量PCR检测法Ct值比较（±s，n =5）

标准菌株改良碱裂解法一步法磁珠法FP R.miehei18.72±0.1817.42±0.4618.97±0.4622.375＜0.001 L.corymbifera16.23±0.1321.23±0.2514.53±0.042 298.548＜0.001 M.circinelloides16.77±0.2815.38±0.8816.13±0.208.152＜0.006

3 讨论

毛霉菌是继曲霉之后在免疫功能低下的患者如血液系统恶性肿瘤患者、造血干细胞移植和实体器官移植患者中常见的丝状真菌病原体。目前临床上确诊毛霉菌主要通过分离培养和表型鉴定，但该种方法耗时长，对操作人员专业要求高，结果判断主观性较强，不能满足临床上对其快速准确诊断的要求。PCR检测方法可以早期检测培养物、组织、血液和尿液等不同样本类型中的毛霉菌，被认为是一种无创的方法[10]。而核酸提取是PCR检测过程中至关重要的一个环节，提取核酸的质量和效率直接影响PCR扩增结果的准确性，若提取的核酸纯度和浓度较低，可能导致PCR检测出假阴性结果。毛霉菌与其他真菌相似，具有厚重的细胞壁，其核酸提取较细菌和人体组织细胞DNA的提取难度大。目前常用于真菌核酸提取的方法有SDS裂解法、CTAB法、反复冻融裂解法等，但都存在操作繁琐、费时费力、提取核酸效率低等缺点[8,9]。为此，本研究采用改良碱裂解法、一步法及磁珠法对不同属的毛霉菌（R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides）分别提取核酸，从提取毛霉菌核酸的浓度及PCR扩增后Ct值进行效能比较，从中筛选出适合临床实验室毛霉菌核酸快速提取的实用方法。

本研究采用改良碱裂解法、一步法及磁珠法提取R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides3株毛霉菌，结果显示三种提取方法均能提取出毛霉菌核酸，提取的毛霉菌核酸浓度差异有统计学意义（均P＜0.05），其中磁珠法提取的毛霉菌标准菌株DNA浓度低于一步法和改良碱裂解法，这与不同提取方法的原理有关[11-12]：①磁珠法是使用高浓度异硫氰酸胍或十二烷基硫酸钠将细胞破坏，使核酸游离出来，在高盐低pH值的情况下与磁珠表面硅基结合，经过洗涤、漂洗、吸干，最后在低盐高pH值的环境下将核酸释放出来，可有效去除PCR干扰物，但存在DNA损失。②一步法和改良碱裂解法是直接将样本与裂解液混合，室温或加热提取核酸的方法，提取的核酸里不仅有核酸，还有蛋白质等杂质，但提取过程中基本不存在DNA损失。

为使结果具有可比性，本研究采用除了核酸提取方法不同外，其余的核酸模板上样量、PCR扩增试剂和PCR扩增仪均一致，并同时检测。结果表明3种方法提取的3株毛霉菌核酸均能扩增出阳性结果，且提取的不同种毛霉菌核酸产物扩增后Ct值呈现多样性，差异有统计学意义（均P＜0.01）。改良碱裂解法提取R.miehei菌株的核酸产物扩增后Ct值和磁珠法差异无统计学意义（P＞0.05），提取L.corymbifera菌株的核酸产物扩增后的Ct值小于一步法，差异有统计学意义（P＜0.01），提取M.circinelloides菌株的核酸产物扩增后的Ct值虽都大于一步法和磁珠法，但在进行实时荧光定量PCR扩增反应40个循环中，其扩增后结果为强阳性（Ct值为17.57±0.26）。本研究还发现，改良碱裂解法在耗时、耗费成本和设备依赖度等方面均优于一步法和磁珠法。因此对模板核酸的纯度没有严格要求时，从经济、可操作性角度等方面综合考虑改良碱裂解法提取毛霉菌核酸更实用。由于本实验室进行实验的阳性样本均为标准菌株培养物，样本类型单一，样本中是否含有其他干扰核酸提取和抑制PCR扩增的物质还不得而知，所以用患者的不同阳性标本类型进行提取效率的验证值得探索。

综上所述，改良碱裂解法、一步法及磁珠法均可用于毛霉菌核酸提取，且提取的毛霉菌标准菌株核酸均能扩增出阳性结果。改良碱裂解法可在短时间内快速提取毛霉菌核酸，所需成本低，操作简便，所提取的毛霉菌核酸模板的浓度可满足实时荧光定量PCR扩增的要求，因此为了节省时间和成本可应用改良碱裂解法提取毛霉菌核酸。