原发性肾病综合征患儿治疗前后外周血CXCL13和PD-L1+B淋巴细胞水平变化及临床意义研究

胡 洋，扬 力，陈 静（邯郸市中心医院.病案科；.内分泌科；.生殖科，河北邯郸 056000）

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是儿童常见的肾小球疾病之一，首选用药为糖皮质激素治疗，但是约90%患儿会在治疗过程中出现激素依赖和复发，PNS病情进展与激素耐药和激素依赖有关[1-2]。近年有研究表明，PNS发病与免疫功能紊乱关系密切，细胞免疫和体液免疫功能异常同时存在[3-4]。临床研究也发现，B淋巴细胞耗竭剂利妥昔单抗治疗能有效降低难治性PNS复发频次[5-6]，提示B淋巴细胞功能异常参与PNS发病。趋化因子C-X-C基序配体13（chemokine C-X-C motif ligand 13，CXCL13）是B淋巴细胞趋化因子，可吸附、直接调控B细胞的成熟和发育，参与机体免疫系统信号传递[7]。CXCL13/CXCR5共同作用参与外周循环B淋巴细胞归巢到淋巴结的过程，并促进次级淋巴结内B淋巴细胞分化为浆细胞，调控体液免疫[8]。程序性死亡受体配体1（programmed death protein ligand 1,PD-L1）与程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）结合可抑制机体免疫细胞分泌细胞因子[9]。有学者报道，B细胞膜上表达的PD-L1与PD-1表达阳性的T细胞结合，可以抑制T淋巴细胞的活化增殖及间接影响生发中心B细胞的形成和发展[10]。实体肿瘤中也证实，调节性B细胞膜上PD-L1高表达，通过PD-1/PD-L1轴能够抑制T细胞对肿瘤细胞的免疫抑制作用[9]。目前有关PNS与B淋巴细胞功能异常的研究有限，本文探究了PNS患儿治疗前后外周血中CXCL13和PD-L1+B淋巴细胞水平变化，并讨论了PNS免疫功能紊乱的可能机制，期望为儿童PNS研究提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2022年4～12月邯郸市中心医院收治的激素敏感型初发PNS患儿52例进行研究，男性35例，女性17例，年龄2.36～12.05(6.43±2.61)岁；诊断符合2016 版《儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治指南》[11]的标准，入院后给予糖皮质激素治疗。排除入院前使用免疫制剂或糖皮质激素治疗患儿；①并发感染、免疫性疾病、内分泌疾病及恶性肿瘤等继发性因素；②并发其他肾脏疾病史和继发性PNS。另选取同期本院健康体检儿童30例为对照，男性19例，女性11例，年龄2.14～12.10 (6.52±2.73)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（t/χ2=0.148，0.134，P=0.833，0.715）。所有家属知情并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 BV650标记的抗人CD19抗体，FITG标记的抗人PD-L1抗体（Biolegend公司）；LSRFortessaTM型流式细胞仪（美国 BD Biosciences公司）；酶联免疫吸附法检测试剂盒（上海酶联生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法与疗效判定：所有患儿均给予醋酸泼尼松片（江苏恒瑞制药有限公司，生产批号200226），按照患儿体重2 mg/（kg·d），分3次口服，服用4周后开始逐渐减量，每4周减5.0 mg，治疗6个月。疗效判定：完全缓解以血生化、尿检完全正常为标准。

1.3.2 外周血B细胞及PD-L1+B淋巴细胞检测：收集所有儿童晨起空腹静脉血2 ml，EDTA抗凝，密度梯度离心法分离单个核细胞，2 500 r/min离心弃上清，PBS洗涤2次，用PBS重悬细胞调整浓度为1×106个/ml，吸取100 μl，加入CD19-BV650，PDL1-FITC抗体各1 μl混匀，每个对照组管加入抗FITC，BV650标记的同型抗体，室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液，混匀静置15 min，加入2 ml PBS，离心弃上清，于流式细胞仪检测外周血中总B细胞（CD19+B）及PD-L1+B淋巴细胞百分比，用Cell Quest软件进行分析。

1.3.3 血清CXCL13，sPD-L1及细胞因子水平检测：收集所有儿童晨起空腹静脉血6 ml，EDTA抗凝，2 500 r/min离心取上清液，采用酶联免疫吸附法分别检测患儿血清中CXCL13和可溶性PD-L1（sPD-L1），同时检测两组转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-1β（IL-1β）等细胞因子水平。

1.3.4 临床数据收集：收集患儿血清清蛋白（albumin，ALB）、24h尿蛋白定量、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、总T细胞计数（CD3+T）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0统计分析软件。对计量资料进行K-S检验显示均方差齐性符合正态分布，数据以均数±标准差 (±s) 表示，两组间比较采用独立样本t检验，PNS组治疗前后比较采用配对样本t检验。PNS患儿外周血PD-L1+B淋巴细胞和CXCL13及与实验室指标的相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床实验室指标比较 见表1。与健康对照组比较，PNS组ALB和IgG水平降低，24h尿蛋白定量及IgM和总T细胞计数升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），两组Scr，BUN比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 两组临床实验室指标水平比较（±s）

表1 两组临床实验室指标水平比较（±s）

项 目健康对照组PNS组t值P值ALB（g/L）47.36±3.1316.42±2.4749.473＜0.001 24h尿蛋白定量（mg/kg·d）6.57±1.56104.05±28.49-18.675＜0.001 Scr（mmol/L）3.86±1.064.13±1.23-1.0060.318 BUN（umol/L）31.34±4.8532.25±5.08-0.7940.429 CD3+T计数（个）1283.18±285.392070.64±371.15-10.027＜0.001 IgM（g/L）1.09±0.341.74±0.53-6.031＜0.001 IgG（g/L）5.37±1.243.49±1.585.594＜0.001

2.2 两组B细胞、PD-L1+B淋巴细胞及血清CXCL13，sPD-L1和细胞因子水平比较 见表2。与健康对照组比较，PNS组治疗前患儿外周血总B细胞、PD-L1+B淋巴细胞及血清CXCL13，sPD-L1，TGF-β1，TNF-α，IL-10和IL-1β水平均明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；PNS组患儿治疗后各细胞及血清指标水平均较治疗前下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组B细胞、PD-L1+B淋巴细胞及血清CXCL13，sPD-L1和细胞因子水平比较（±s）

表2 两组B细胞、PD-L1+B淋巴细胞及血清CXCL13，sPD-L1和细胞因子水平比较（±s）

PNS组治疗前 vs 健康对照组治疗后 vs 治疗前治疗前治疗后tPtP总B细胞（%）4.95±2.8312.54±4.236.20±2.48-10.754＜0.0019.324＜0.001 PD-L1+B淋巴细胞（%）0.35±0.121.17±0.380.43±0.25-11.468＜0.00111.731＜0.001 CXCL13（pg/ml）53.67±12.42121.03±30.5265.27±14.16-11.526＜0.00111.951＜0.001 sPD-L1（pg/ml）47.27±8.14116.25±25.6855.63±11.44-14.271＜0.00115.549＜0.001 TGF-β1（ng/ml）12.53±1.6217.91±2.0414.35±1.82-12.360＜0.0019.930＜0.001 TNF-α（ng/ml）52.43±4.6877.65±7.2756.48±4.16-17.048＜0.00118.226＜0.001 IL-10（pg/ml）4.76±1.2514.21±3.565.15±1.09-14.017＜0.00117.548＜0.001 IL-1β（ng/ml）35.57±5.9264.38±7.4639.38±4.05-18.103＜0.00121.237＜0.001项 目健康对照组

2.3 PNS患儿外周血PD-L1+B淋巴细胞和CXCL13及与实验室指标的相关性 见表3。Pearson相关性分析，PD-L1+B淋巴细胞比例与ALB和IgG水平呈负相关，与IgM水平呈正相关，差异有统计学意义（均P＜0.05）；CXCL13表达水平与ALB和IgG水平呈负相关，差异有统计学意义（均P＜0.05）；PD-L1+B淋巴细胞比例与CXCL13表达水平呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 相关性分析结果

3 讨论

目前原发性肾病综合征（PNS）发病机制尚未完全明确，研究发现患儿外周血淋巴细胞亚群比例改变，PNS频繁复发和激素耐药与患儿体内免疫功能异常有关，监测治疗过程中发现免疫功能明显变化，证实PNS发病与免疫功能紊乱密切相关[12]。PNS发病涉及细胞机制、免疫致病、炎症介质损伤和遗传因素[1]，其中免疫致病的相关因素研究是PNS近年的热点。

PNS发病与T细胞亚群紊乱及致病T细胞因子升高有关，T淋巴细胞介导的细胞免疫在PNS发病中发挥主导作用[13]。有研究发现，PNS不仅与T淋巴细胞介导的免疫有关，也和B细胞介导的体液免疫关系密切[14]。在疾病活动期频繁复发型和激素依赖型PNS患儿总B细胞、记忆B细胞、过渡B细胞水平明显升高。随着免疫抑制剂环磷酰胺（影响B细胞存活）和生物制剂利妥昔单克隆抗体（耗竭B细胞）药物在PNS中的应用，发现有效地预防了疾病复发，证实由B细胞介导的体液免疫参与PNS发病[5-6]。本研究结果检测证实PNS患儿体内免疫紊乱。最新研究发现，程序性死亡受体配体1（PD-L1）+B淋巴细胞与滤泡辅助性T细胞上表达的程序性死亡受体1（PD-1）结合抑制该T细胞的生成，降低体液免疫活化所需的辅助作用，在自身免疫性疾病和体液免疫疾病中发挥重要作用[17-18]。通常PD-L1+B细胞在各种疾病中扮演着免疫应答的负性调节作用，而在PNS研究中，吕治安等[19-20]研究表明，PD-1/PD-L1信号参与了PNS的发病过程。本研究亦发现外周血PD-L1+B淋巴细胞和血清sPD-L1表达升高与PNS发病相关。低ALB是PNS诊断的特征条件之一，主要原因是肾小球通透性改变或滤过屏障损伤造成ALB从尿液中大量丢失[21]。大多数PNS在初发期和复发期均存在低IgG血症，说明分泌免疫球蛋白的B细胞免疫功能紊乱，IgM则升高[22]。本研究中得出PD-L1+B淋巴细胞表达均与ALB，IgG和IgM显著相关，分析PD-L1+B细胞可能促进PNS患儿的体液免疫反应，造成IgM和IgG分泌异常。

趋化因子C-X-C基序配体13（CXCL13）是唯一可与CXCR5受体结合的配体，稳定表达于成熟的B细胞、辅助性及调节性T细胞，参与免疫调控[7]。据文献报道，CXCL13能够调控外周循环B淋巴细胞归巢到淋巴结的过程，可促进次级淋巴结内B淋巴细胞分化为浆细胞，发挥体液免疫[23]。自身免疫性疾病中已证实CXCL13存在异常，本研究也表明CXCL13高表达参与了PNS发病。另外有学者报道，免疫反应失衡和炎症反应亢进与PNS有关，炎症介质TGF-β1和TNF-α等作用于肾小球，可介导炎症损伤，参与免疫反应，诱发PNS的发生[17]。ANSEL等[24-25]报道，CXCL13作为B淋巴细胞趋化剂，与CXCR5结合可选择性的介导外周血中B细胞的趋化性，增加B细胞产生释放IL-10和IL-1β等细胞因子，参与免疫调节。最新研究表明，CXCL13可作为糖皮质激素治疗的一种血清标志物，反映B细胞免疫的效应程度[21]。本研究结果表明PNS患儿自身存在炎症反应，疾病发生期CXCL13和炎症细胞因子释放增加；治疗后机体免疫紊乱改善，炎症反应受到抑制，猜测CXCL13可能通过促进外周血B淋巴细胞趋化性，促进免疫细胞生产炎症细胞因子，引起炎症和抗炎反应激活，加重PNS早期过度免疫炎症反应。然而B细胞介导的免疫与PNS的关系研究较少见，具体作用调控分子机制仍需后期进一步的研究明确。积极研发靶向CXCL13的抑制剂或药物，或许能通过抑制B淋巴细胞趋化性，进而减轻过度免疫炎症反应，降低PNS对患儿的损害，为PNS早期诊疗提供新的策略。

综上所述，CXCL13和PD-L1+B淋巴细胞比例升高与PNS患儿免疫系统紊乱相关。CXCL13可能通过促进外周血中B淋巴细胞趋化性，增加免疫细胞生产炎症细胞因子，加重PNS早期过度免疫炎症反应。