早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1表达水平与支气管肺发育不良的相关性研究

张 磊，王海萍，李 静，李永波，于 胜，闫小平，周 盈

（1.潍坊市妇幼保健院 a.新生儿科；b.儿童康复科，山东潍坊 261011；2.潍坊高新区人民医院预检科，山东潍坊 261000；3.国药医疗潍坊医院中医科，山东潍坊 261044；4.临朐县海浮山医院骨科，山东潍坊 262605；5.寒亭区人民医院小儿内科，山东潍坊 261199）

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是由高浓度氧、气压伤、炎症等多种因素导致肺发育不成熟的慢性肺损伤疾病，是早产儿最严重、最常见的呼吸系统并发症，目前对BPD的发病机制尚不清楚，仍然无有效的救治BPD的方法[1-2]。因此，寻找与BPD有关的血清标记物预测BPD的发生，在减少BPD的发生及提高早产儿的生存质量方面具有极其重要的意义。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为一类可调节基因表达的重要小分子，研究表明，miRNA广泛参与调控细胞的生长、凋亡、炎症反应等病理生理过程[3-4]。miR-125b作为miRNA中的一员，在急性肺损伤大鼠肺组织中表达水平显著降低，其通过上调炎性因子，从而参与肺部炎症反应[5]。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）在基因转录调控中发挥作用，参与调控胚胎发育、免疫调节等过程[6-7]。转移相关肺腺癌转录本-1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）属于LncRNA，其水平异常升高与早产儿BPD的发生有关[8]。但miR-125b，LncRNA MALAT1单独及联合对早产儿BPD的预测价值尚有待验证。因此，本研究通过检测早产儿血清miR-125b和LncRNA MALAT1水平，并探讨二者与BPD的关系，以期为临床诊断BPD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 采用前瞻性研究的方法，选取2020年4月～2021年4月入住潍坊市妇幼保健院新生儿重症监护室（new intensive care unit，NICU）的227例早产儿作为研究对象，其中男性110例，女性117例，胎龄29～37周，平均胎龄33.66±3.01周，根据是否患有BPD将所有早产儿分为：BPD组（n=55）和无BPD组（n=172）。其中BPD组男性25例，女性30例，平均胎龄32.98±2.97周，出生体质量1.65±0.30kg；有30例母体使用产前激素，32例患有母体孕期炎症，8例母体患有妊娠期糖尿病，22例属于自然分娩，7例属于出生窒息；分娩中给氧时间34.54±9.21天，机械通气时间23.97±1.30h。无BPD组男性85例，女性87例，平均胎龄33.88±3.02周，出生体质量1.74±0.37kg；有118例母体使用产前激素，80例患有母体孕期炎症，24例母体患有妊娠期糖尿病，69例属于自然分娩，9例属于出生窒息；分娩中给氧时间17.28±5.22天，机械通气时间4.71±2.26h。两组早产儿一般资料中早产儿性别、胎龄、出生体质量、产前激素使用、母体孕期炎症、妊娠期糖尿病、自然分娩、出生窒息方面差异均无统计学意义（χ2/t=0.262，1.931，1.639，3.630，2.271，0.012，0.000，3.573，均P＞0.05）；BPD组早产儿给氧时间、机械通气时间长于非BPD组，差异具有统计学意义（t=17.387，60.047，均P＜0.01）。

纳入标准 ①出生胎龄＜37周；②出生后进行血液生化检测；③病例资料完整；④患儿家属知情并签署知情同意书。排除标准：①出生后28天内死亡；②严重先天性畸形；③并发感染或血液性疾病；④并发遗传性代谢疾病以及先天性心脏病；⑤肾功能衰竭患儿；⑥中途放弃治疗或转院。BPD诊断标准：符合《实用新生儿学》（第5版）关于BPD的诊断标准[9]：指任何氧依赖（吸入氧浓度＞21%）超过28天的早产儿。按矫正胎龄36周或出院时吸氧浓度将BPD组患儿分为：无需用氧为轻度BPD组（n=19）、用氧浓度＜30%为中度BPD组（n=18）和用氧浓度≥30%或者机械通气为重度BPD组（n=18）。本研究经本院伦理委员会批准后实施。

1.2 仪器与试剂 高速离心机（美国贝克曼库尔特），实时荧光定量PCR仪（型号：ProFlex），RNA提取试剂盒（赛默飞），miRNA逆转录试剂盒（Takara公司）。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集：收集以下临床一般资料：早产儿性别、胎龄、出生体质量、产前激素使用、母体孕期炎症、妊娠期糖尿病、自然分娩、出生窒息、给氧时间、机械通气时间。

1.3.2 样品采集：抽取所有早产儿进入NICU后第1，10和14天的外周静脉血3ml，以3 200r/min离心10min，分离血清，并置于-80℃环境中保存待测。

1.3.3 早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平检测：实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1的相对表达量。引物序列详见表1。qRT-PCR反应体积为15 ml，反应条件为95℃1 min；95℃15 s；75℃30 s。以U6作为miR-125b的内参基因，以GAPDH作为LncRNA MALAT1的内参基因，计算得到Ct值，采用2-ΔΔCt法分析血清miR-125b和LncRNA MALAT1的相对表达量。

1.4 统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，行独立样本t检验；计数资料用[n（%）]来描述，行χ2检验；使用ROC曲线分析血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平对早产儿BPD预测的准确性，同时寻找出miR-125b和LncRNA MALAT1预测早产儿BPD的最佳截断值；采用多因素Logistic回归分析影响早产儿BPD的有关因素。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 两组早产儿血清miR-125b和LncRNA MALAT1水平比较 见表2。结果显示，进入NICU后第10和14天，BPD组早产儿血清miR-125b水平均低于无BPD组，差异具有统计学意义（均P＜0.05），血清LncRNA MALAT1水平均高于无BPD组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平比较（±s）

表2 两组早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平比较（±s）

项 目时间（天）BPD组（n=55）无BPD组（n=172）t值P值miR-125b 1 0.96±0.251.01±0.151.8020.073 10 0.70±0.180.99±0.1213.683＜0.001 14 0.48±0.161.02±0.1621.787＜0.001 1 1.05±0.301.00±0.141.6900.092 10 1.52±0.411.03±0.1513.198＜0.001 14 2.02±0.611.02±0.1120.569＜0.001 LncRNA MALAT1

2.2 不同严重程度的BPD早产儿血清miR-125b和LncRNA MALAT1水平比较 见表3。血清miR-125b水平在轻度BPD组、中度BPD组、重度BPD组中依次降低，血清LncRNA MALAT1水平在轻度BPD组、中度BPD组、重度BPD组中依次升高，差异具有统计学意义（F=15.872，14.084，均P＜0.05）。

表3 不同严重程度的BPD早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平比较（±s）

表3 不同严重程度的BPD早产儿血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平比较（±s）

注：a与轻度BPD组比较，t=4.307，7. 95；3.711，7.505，均P＜0.05；b与中度BPD组比较，t=3.596，3.744，均P＜0.05。

项 目轻度BPD组（n=19）中度BPD组（n=18）重度BPD组（n=18）F值P值miR-125b0.60±0.160.47±0.12a0.36±0.10ab15.872＜0.001 lncRNA MALAT11.54±0.421.99±0.51a2.45±0.62ab14.084＜0.001

2.3 血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平预测早产儿BPD的价值 ROC分析结果显示，血清miR-125b预测早产儿BPD的曲线下面积（AUC）为0.820（0.765～0.875），最佳诊断截点为0.59，敏感度和特异度分别为78.18%，74.42%；LncRNA MALAT1预测早产儿BPD的AUC为0.773（0.685～0.861），最佳诊断截点为1.71，敏感度和特异度分别为60.00%，92.44%；两个指标联合预测的价值最高，AUC为0.902（0.855～0.948），敏感度和特异度分别为80.00%，86.63%。见图1。

图1 血清miR-125b，LncRNA MALAT1水平预测早产儿BPD的ROC曲线

2.4 多因素Logistic回归分析影响早产儿BPD的相关因素 见表4。以早产儿是否发生BPD作为因变量（BPD=1，无BPD=0），以给氧时间、机械通气时间、miR-125b，LncRNA MALAT1指标作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示给氧时间（OR：2.135，95%CI：1.241～3.674，P=0.006）、机械通气时间（OR：2.187，95% CI：1.132～4.225，P=0.020）、LncRNA MALAT1（OR：2.016，95% CI：1.190～3.416，P=0.009）是早产儿BPD的独立危险因素，miR-125b（OR：0.699，95% CI：0.552～0.884，P=0.003）是早产儿BPD的独立保护因素。

表4 多因素Logistic回归分析影响早产儿BPD的相关因素

3 讨论

支气管肺发育不良（BPD）不但致使肺血管改变，还导致心脏舒张功能障碍，BPD的具体发病机制尚不清楚。主要病理特征为肺泡和肺微血管发育不良，其特征是肺泡缩小、增大、肺泡结构简化和肺微血管形态异常，但肺泡和呼吸道损伤和纤维化较轻。近年来，许多研究证明，高氧暴露是影响气道和肺血管异常发展的重要因素[10-11]。BPD的病程一般几个月或几年，因为大多BPD患儿慢性缺氧，造成机体能量耗损过快，加上饮食困难，进而导致患儿营养不良。此外，发病过程中经常因为继发性呼吸道感染频繁发作引起BPD患儿进行性呼吸衰竭从而导致死亡。因此，为降低BPD的发病率，改善早产儿的生存质量及预后，寻找与BPD有关的生物标记物具有重要意义[12-13]。

miRNAs在基因转录后通过调控其水平的表达来发挥生物学作用，近年来，随着人们对miRNA研究的深入，发现其在肺发育过程中具有非常重要的作用[14]。例如CHENG等[15]研究报道，miR-203a-3p敲低减轻了BPD大鼠模型中高氧诱导的肺组织损伤，其作用可能与血管内皮生长因子A的上调有关；TAO等[16]研究发现，长链非编码RNA Rian通过海绵化miR-421防止实验性支气管肺发育不良。miR-125b是miRNAs的重要成员之一，参与调控细胞分化、凋亡以及炎症反应，也在肿瘤的转移及侵袭等病理生理过程都有广泛参与。MA等[17]研究结果表明，姜黄酚通过SP1/miR-125b-5p/VEGFA轴抑制非小细胞肺癌的细胞增殖和血管生成。何梅俊等[18]研究结果表明，将miR-125b-5p转染至小鼠海马神经元细胞HT22中后，发现该细胞存活率远高于未转染miR-125b-5p的HT22细胞，提示miR-125b-5p过表达可促进HT22细胞增值。ZHANG等[19]研究结果表明，miR-125b在高氧组早产儿新生大鼠中的表达呈先逐渐升高后降低的趋势，miR-125b有助于防止BPD作为Nrf2的下游靶标。LncRNA MALAT1定位于人类染色体11q13.1，在肺部疾病及多种恶性肿瘤中高表达。范林等[20]研究报道，LncRNA MALAT1水平可能参与高氧致新生鼠BPD的过程，其水平升高可能促进肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖。ZHANG等[21]研究证实，LncRNA MALAT1可通过靶向miR-206加剧BPD的发病机制。另外，ZHANG等[22]研究发现，与对照组相比，BPD早产儿LncRNA MALAT1的表达明显升高，LncRNA MALAT1可通过减少细胞凋亡和抗氧化作用在BPD中发挥保护作用，为临床治疗BPD提供了新途径。另外，张红专等[8]研究也发现，BPD组早产儿外周血LncRNA MALAT1水平较非BPD组高。但miR-125b，LncRNA MALAT1是否可作为早产儿BPD的预测指标尚不清楚，因此，本研究探讨miR-125b，LncRNA MALAT1对早产儿BPD的预测价值有一定意义。

动物实验研究显示[23]，高氧组和空气组早产大鼠肺组织中miR-125b的表达自第1天后逐渐升高，第10 天时达到高峰，高氧暴露（第1，4，7 天时）早产大鼠肺组织中miR-125b的表达高于空气组，而第10 天和14 天时肺组织中miR-125b的表达低于空气组，说明miR-125b的表达与研究样本的选取时间有关。本研究于早产儿进入NICU后第10天和14 天收集血清标本，通过检测血清miR-125b和LncRNA MALAT1水平，发现随着进入NICU时间延长，BPD组早产儿血清miR-125b水平逐渐降低，血清LncRNA MALAT1水平逐渐升高，且进入NICU后第10和14 天，BPD组早产儿血清miR-125b水平明显低于无BPD组，血清LncRNA MALAT1水平明显高于无BPD组，与动物实验[23]研究结果具有相似性，提示miR-125b和LncRNA MALAT1表达可能与BPD有关，且与入住NICU时间密切相关。进一步研究显示，血清miR-125b水平重度BPD组＜中度BPD组＜轻度BPD组，血清LncRNA MALAT1水平轻度BPD组＜中度BPD组＜重度BPD组，多因素Logistic回归分析表明miR-125b和LncRNA MALAT1是早产儿BPD的影响因素，与ZHANG等[19]和张红专等[8]实验结果类似，提示miR-125b水平随病情的加重而降低，LncRNA MALAT1水平随病情的加重而升高，可作为评估病情及是否发生BPD的指标。ROC曲线分析显示，miR-125b和LncRNA MALAT1预测早产儿BPD发生的AUC分别为0.820，0.773，提示miR-125b和LncRNA MALAT1对早产儿BPD发生具有一定的预测效能，进一步发现二者联合预测早产儿BPD发生的AUC和敏感度较高，提示二者联合有更高的预测价值，表明miR-125b和LncRNA MALAT1均有望成为早产儿BPD发生的预测因子。

综上所述，miR-125b和LncRNA MALAT1水平与早产儿BPD有关，二者水平与BPD严重程度具有相关性，检测早产儿血清miR-125b和LncRNA MALAT1水平可为判断BPD发生及病情严重程度提供理论依据。但本研究为单中心、小样本研究，血清miR-125b和LncRNA MALAT1水平对BPD的评估价值可能有所偏倚，需要在未来加大样本量，并进行多中心研究论证本研究结论。