急性淋巴细胞白血病儿童血清miR-1301-3p和PODXL表达水平及其临床价值研究

岳俊刚，陈 芳（江油市第二人民医院检验科，四川江油 621701）

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是儿童最常见的一种恶性肿瘤，起源于造血干细胞向淋巴细胞分化过程中的恶性增殖，与染色体变异、基因突变、蛋白异常表达等因素有关，其具体发病机制暂未明确[1-2]。微小核糖核酸（microRNA，miR）具有调控蛋白质翻译和mRNA稳定性的作用[3]。研究表明，miRNAs的异常表达和儿童急性淋巴细胞白血病关系密切，可将其作为诊断儿童急性淋巴细胞白血病，并预测患者预后的生物标志物[4-5]。据报道，miR-1301-3p可作为肺癌的生物标志物[6]。足糖萼蛋白（podocalyxin，PODXL）可调控癌细胞的增殖、凋亡，并广泛存在于多种恶性肿瘤中[7]。研究发现，在成熟的B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞增殖、存活、迁移、耐药性和代谢重编程过程中PODXL具有重要作用[8]。目前，miR-1301-3p和PODXL在儿童急性淋巴细胞白血病中作用的研究鲜有报道。因此本研究通过检测儿童急性淋巴细胞白血病患者血清miR-1301-3p和PODXL表达情况，探讨miR-1301-3p和PODXL对儿童急性淋巴细胞白血病患者的诊断和预后价值，为相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年1月～2019年1月在江油市第二人民医院就诊的146例儿童急性淋巴细胞白血病患者作为观察组，收集其临床资料。其中男性81例，女性65例；＜8岁90例，≥8岁56例，平均年龄8.50±3.60岁。另选择同期在本院体检的健康儿童100例作为对照组，其中男性55例，女性45例，＜8岁55例，≥8岁45例，平均年龄8.30±3.92岁。本研究经家属知情同意并签署知情同意书，且经江油市第二人民医院伦理委员会批准。

纳入标准：①年龄≤14岁患者；②新发急性淋巴细胞白血病患者；③诊断、分型符合中华医学会制定的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第四次修订)》[9]患者；④临床资料完整患者。排除标准：①非首次确诊、经过放疗化疗的患者；②由其他类型的白血病转化导致的急性淋巴细胞白血病患者；③并发血液系统疾病、恶性肿瘤或自身免疫疾病的患者。

1.2 仪器与试剂 TRIzol试剂（货号：NR0002，北京雷根生物技术有限公司）；miRNA-T反转录试剂盒（货号：ST-200158-H，北京依托华茂生物科技有限公司）；荧光定量PCR试剂盒（货号：BES-21153CBR，上海博尔森生物科技有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（型号：F-430，美国Bio-Rad公司），PODXL 酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：QS9814-A，上海钦胜生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品采集：采集观察组患者确诊当天和对照组健康儿童体检当天的静脉血4 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清。

1.3.2 qRT-PCR检测血清miR-1301-3p相对表达量：使用TRIzol法提取血清总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA（反转录反应体系：总RNA 2μl，RNase Free dH2O（20 μl），Prime-Script RT Master Mix（4μl））后进行qRT-PCR反应，qRT-PCR检测条件：95℃预变性5 min，循环1次，95℃变性30s，55℃退火45s，75℃延伸15s，共循环35次。以U6为内源对照，以2-ΔΔCt法计算miR-1301-3p的表达水平。引物由上海烜雅生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 ELISA法检测血清PODXL：采用ELISA检测血清PODXL表达水平，操作过程严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.4 随访：从患者初次确诊为儿童急性淋巴细胞白血病开始，进行为期三年的随访，通过门诊或电话的方式记录患者生存情况。随访截止时间为2022年1月31日。随访终点为患者死亡或者随访结束。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0作为本研究的统计学分析软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以n（%）表示，两组间比较采用χ2检验；血清miR-1301-3p和PODXL表达水平关系采用Pearson相关性方法；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic curves，ROC）曲线评估患者血清miR 1301 3p和PODXL的表达对儿童急性淋巴细胞白血病的诊断价值，采用Z检验比较ROC曲线下面积（area under curve，AUC）；采用Kaplan-Meier法分析患者血清miR-1301-3p和PODXL表达对预后的影响；采用COX回归分析影响儿童急性淋巴细胞白血病的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-1301-3p和PODXL表达水平及相关性分析 观察组血清miR-1301-3p（0.81±0.13）表达水平低于对照组（0.98±0.11），血清PODXL（18.69±4.96 ng/ml）表达水平高于对照组（15.56±4.32 ng/ml），差异具有统计学意义（t=10.710，5.119，均P＜0.001）。经Pearson相关性分析，观察组血清miR-1301-3p和PODXL表达水平呈负相关（r=-0.487,P＜0.05）。

2.2 血清miR-1301-3p和PODXL表达水平对儿童急性淋巴细胞白血病的诊断价值分析 见图1。ROC曲线分析显示，血清miR-1301-3p诊断儿童急性淋巴细胞白血病的AUC为0.858（95%CI：0.806～0.910），截断值为0.897，敏感度和特异度分别为78.1%，88.0%，约登指数为0.661；血清PODXL诊断儿童急性淋巴细胞白血病的AUC为0.729（95%CI：0.665～0.792），截断值为16.740，敏感度和特异度分别为50.0%，87.0%，约登指数为0.370；miR-1301-3p和PODXL联合诊断儿童急性淋巴细胞白血病的AUC为0.930（95%CI：0.893～0.967），显著大于miR-1301-3p和PODXL单独诊断的AUC（Z=2.236，P=0.025；Z=5.428，P＜0.001），敏感度和特异度分别为94.5%和85%，约登指数为0.795。

图1 血清miR-1301-3p和PODXL表达诊断儿童急性淋巴细胞白血病的ROC曲线

2.3 miR-1301-3p和PODXL表达与患者临床特征的关系 见表2。分别以miR-1301-3p和PODXL的ROC曲线分析的截断值0.897，16.740 ng/ml为界限，将146例急性淋巴细胞白血病患者分为miR-1301-3p低表达组（n=98）和miR-1301-3p高表达组（n=48），PODXL低表达组（n=58）和PODXL高表达组（n=88）。两组间卡方检验显示，miR-1301-3p低表达组患者的中高危险分层、白细胞计数≥50×109/L，MLL基因重排阴性、染色体核型异常、淋巴结肿大的比例均高于miR-1301-3p高表达组，差异具有统计学意义（χ2=11.333，12.962，5.773，4.375，5.047，均P＜0.05）；PODXL高表达组患者的中高危险分层、白细胞计数≥50×109/L，MLL基因重排阴性、染色体核型异常和淋巴结肿大比例均高于PODXL低表达组患者，差异具有统计学意义（χ2=7.912，7.038，11.843，11.440，23.708，均P＜0.05）。

表2 血清miR-1301-3p和PODXL表达水平与患者临床病理特征的关系[n（%）]

2.4 miR-1301-3p和PODXL表达与患者生存率的关系 见图2。对146例儿童急性淋巴细胞白血病患者进行为期三年的随访。Kaplan-Meier法分析结果显示，miR-1301-3p低表达组的总生存率(39.80%)低于miR-1301-3p高表达组(62.50%)，PODXL高表达组的总生存率(38.64%)低于PODXL低表达组(60.34%)，差异有统计学意义（χ2=10.31，9.419，均P＜0.05）。

图2 miR-1301-3p和PODXL表达与患者生存率的关系

2.5 COX回归分析影响儿童淋巴细胞白血病预后的危险因素 自变量赋值见表3。以患者生存情况为因变量（0=存活，1=死亡），以白细胞计数（×109/L）、危险分层、染色体核型、MLL基因重排、淋巴结肿大以及miR-1301-3p和PODXL作为自变量进行COX回归分析，见表4。单因素COX回归分析显示，miR-1301-3p低表达、PODXL高表达、白细胞计数≥50×109/L、中高危险分层、染色体核型异常、MLL基因重排阴性、淋巴结肿大是影响儿童急性淋巴细胞白血病患者不良预后的危险因素（P＜0.05）。多因素COX回归分析表明，miR-1301-3p低表达、PODXL高表达、白细胞计数≥50×109/L、中高危险分层、MLL基因重排阴性是影响儿童急性淋巴细胞白血病不良预后的危险因素（均P＜0.05）。

表3 COX回归分析中自变量赋值表

表4 COX回归分析影响患者预后的危险因素

3 讨论

急性淋巴细胞白血病是一种骨髓造血干细胞异常分化、增殖导致的恶性肿瘤，包括多种亚型[10]。急性淋巴细胞白血病多发于儿童和青少年，联合化疗和异基因造血细胞移植是治疗该病的主要方法[11]。急性淋巴细胞白血病是儿童和癌症相关死亡的主要原因，尽管该病的临床治愈率超过85%，但仍有约20%的患者会复发[12-13]。目前，临床尚缺乏诊断儿童急性淋巴细胞白血病并评价其预后的特异性指标，故筛选与该病相关的诊断和预后指标极其重要。

研究表明，miR-1301-3p在多种癌症中发挥重要作用。例如，在前列腺癌细胞和组织中miR-1301-3p表达明显上调，高水平miR-1301-3p能促进前列腺癌发病相关基因表达，诱导前列腺癌干细胞增殖[14]。在非小细胞肺癌组织中，miR-1301-3p的表达水平与非小细胞肺癌患者的TNM分期、淋巴结转移和预后不良显著相关[15]。而在胰腺癌组织中miR-1301-3p表达则下调，且其低表达水平与胰腺癌患者的预后不良密切相关[16]。以上研究表明，在不同癌症中miR-1301-3p的作用机制也各不相同。目前，miR-1301-3p在儿童急性淋巴细胞白血病发病中相关机制仍未明确。本研究中，儿童急性淋巴细胞白血病患者血清miR-1301-3p表达水平低于健康儿童，与上述研究结果一致[16]，且其与危险分层、白细胞计数、MLL基因重排、染色体核型、淋巴结肿大有关，表明血清miR-1301-3p低表达对儿童急性淋巴细胞白血病的发生、发展具有重要作用。此外，本研究中miR-1301-3p低表达患者的总生存率较低，说明低水平miR-1301-3p是影响儿童急性淋巴细胞白血病不良预后的危险因素，可增加儿童急性淋巴细胞白血病患者死亡的风险。PODXL蛋白是一种跨膜蛋白，广泛参与多种肿瘤的发生发展过程[17]。HE等[18]meta分析结果显示，PODXL高表达与胰腺癌和多形性胶质母细胞瘤患者总生存率显著相关。YAO等[19]认为PODXL在卵巢癌中过表达，BBOX1-AS1通过miR-1-1p/PODXL途径诱导卵巢癌细胞生长，提示PODXL可作为卵巢癌治疗的新潜在靶点。本研究中，儿童急性淋巴细胞白血病患者血清PODXL高表达，与上述研究结果类似[19]，且其与危险分层、白细胞计数、MLL基因重排、染色体核型、淋巴结肿大有关，表明高表达PODXL促进了儿童急性淋巴细胞白血病的发生、发展。此外，有报道称，PODXL还可作为多种癌症预后的生物标志物[17]。例如，外周血PODXL水平异常改变与胰腺癌的术后生存率密切相关[20]。本研究中PODXL高表达组的总生存率较低，说明PODXL高表达是影响儿童急性淋巴细胞白血病不良预后的危险因素，与上述研究结果类似[21]。

YU等[21]报道，胃癌中PODXL过表达，且CTCF诱导的LINC01207激活通过调节miR-1301-3p / PODXL轴有助于胃癌进展。本研究也发现血清miR-1301-3p和PODXL表达水平呈负相关，进一步验证二者具有靶向作用，说明在儿童急性淋巴细胞白血病的发生发展过程中二者间存在相互作用。进一步研究发现，血清miR-1301-3p和PODXL联合诊断儿童急性淋巴细胞白血病的AUC显著大于两者单独诊断的AUC，表明二者联合诊断儿童急性淋巴细胞白血病具有更高的诊断价值，故miR-1301-3p和PODXL有望成为诊断儿童急性淋巴细胞白血病的新指标。

综上所述，儿童急性淋巴细胞白血病患者血清miR-1301-3p表达下调、PODXL表达上调，二者与儿童急性淋巴细胞白血病患者的危险分层、白细胞计数、MLL基因重排、染色体核型、淋巴结肿大密切相关，是影响该病患者预后的重要因素，故miR-1301-3p和PODXL可作为诊断儿童急性淋巴细胞白血病并预测患者预后的生物标志物。但本研究未分析儿童急性淋巴细胞白血病的发病机制与miR-1301-3p和PODXL的关系，需继续展开相关研究对其进行深入探索，以获得更为明确的证据，为儿童急性淋巴细胞白血病诊治提供参考。