PCOS患者MTHFR C677T基因多态性与胰岛素峰值后移的相关性研究

朱 琳，陈跃瑜，林延润，杨发达（佛山市南海区妇幼保健院检验科,广东佛山 528200）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄女性常见的内分泌疾病，容易引发糖代谢异常，与胰岛β细胞功能受损有关[1-2]，早期可表现出胰岛素峰值后移[3-4]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR）C677T基因多态性与妊娠期糖尿病及多种糖尿病并发症相关[5-7]，但与胰岛素早期功能受损的相关性报道则较为少见。本研究旨在探讨PCOS患者该基因多态性与胰岛素峰值后移的相关性及其对胰岛素早期功能的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2022年1月～2023年1月在佛山市南海区妇幼保健院就诊的PCOS患者，入组前进行知情同意告知并签字确认，且研究通过了本院伦理委员会批准（伦理文件编号：2022-01）。PCOS诊断标准参照《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》[8]，排除标准：①由于甲状腺功能障碍、高泌乳素血症、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征等因素引起的排卵障碍；②糖尿病患者；③接受过改善胰岛素药物或降糖药物治疗的患者；④研究资料不完整。本课题共入组研究对象194例，2例因空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）异常剔除，1例因呕吐未能按要求完成实验室检查剔除，最终纳入研究对象191例。根据 IRT 实验结果分为后移组（n=65）和无后移组（n=126），两组年龄、身高、体重比较差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表1。

表1 两组的临床资料比较（±s）

表1 两组的临床资料比较（±s）

类别无后移组（n=126）后移组（n=65）tP年龄(岁)25.83±3.6926.65±4.761.210.22体重（kg）52.28±10.9454.17±9.721.200.22身高(cm)156.83±4.98157.73±3.771.390.16

1.2 仪器与试剂 血清胰岛素水平采用罗氏E601进行检测，罗氏原装配套试剂盒；FPG采用AU5800进行检测，试剂为豪迈生物公司检测试剂盒；MTHFR(C677T)基因型检测采用上海百傲科技有限公司提供的试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：纳入的研究对象空腹采集静脉血10ml，无抗凝管、分离胶促凝管、EDTA-K2抗凝管各一支；采血后饮用糖水（含75g葡萄糖），并依次在30，60，120和180min四个时间点分别采集分离胶促凝静脉血各一支（3ml），无抗凝标本和分离胶促凝标本静置30min后离心（3 000r/min，10min）收集血清，EDTA-K2抗凝标本用EP管分装，-80℃保存待测。

1.3.2 标本检测：无抗凝标本收集的血清用于FPG检测，采用葡萄糖氧化酶法；分离胶促凝标本收集的血清用于Fins和相应时间点的血清胰岛素水平（INS30，INS60，INS120，INS180）检测，采用免疫发光法；EDTA-K2抗凝标本先利用磁珠法提取DNA，再通过PCR芯片杂交法进行MTHFR C677T基因型分型。各项目检测均在同一检测平台完成，严格按照操作规范进行检测。

1.3.3 计算公式：ISI=1/[FPG(mmol/L)×Fins(IU/L)]；IRI=FPG(mmol/L)×Fins(IU/L)/22.5; AUC=0.25×Fins＋0.5×（INS30＋INS180）+0.75×INS60＋INS120[9]。

1.4 统计学分析 运用SPSS21.0分析软件分析实验数据，一般临床资料、各项指标先行Kolmogorov-Smirnov检验。患者年龄、身高、体重、INS30以及AUC符合正态分布（P＞0.05），用均数±标准差（±s）表示；其余各时间点胰岛素水平、FPG，ISI和IRI均不符合正态分布（P＜0.05），用中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示。基因型分布先进行Hardy-Weinberg平衡检验，若P＞0.05，则认为基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，有群体代表性；基因型和等位基因频率比较采用χ2检验，不同基因型多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 见表2。两组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，差异无统计学意义（χ2=3.90，2.30，P=0.14，0.32）,样本具有群体代表性。

表2 基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验

2.2 基因型分布和等位基因频率比较 见表3。与无后移组比较，后移组CT型、TT型占比更高，等位基因T的频率高于无后移组；后移组与无后移组基因型和等位基因频率比较，差异均有统计学意义（χ2=12.47，15.06，P=0.020，0.000）。

表3 基因型分布和等位基因频率比较 [n(%)]

2.3 无后移组三种基因型各指标比较 见表4。单因素方差分析显示，无后移组三种基因型的Fins和IRI差异均有统计学意义（F=6.569，5.928，P=0.002，0.003）；与CC型相比，CT型、TT型的Fins和IRI升高，差异均有统计学意义（t=2.66～2.93,P=0.004～0.009）；C向T位点突变，对无后移组Fins和IRI有影响。除此之外其余时间点的胰岛素水平、AUC和FPG差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表4 无后移组三种基因型各指标比较[±s或M（P25，P75）]

表4 无后移组三种基因型各指标比较[±s或M（P25，P75）]

项 目CC基因型（n=77）CT基因型（n=38）TT基因型（n=11）FP Fins(IU/L)8.75(5.43,13.50)12.56(9.39,15.49)12.59(9.56，22.48)6.5690.002 INS30(IU/L)94.65±69.6784.15±41.2282.04±30.480.5080.603 INS60(IU/L)78.53(51.04，131.87)95.35(68.57，125.20)110.78(64.36，167.12)0.2710.763 INS120(IU/L)52.85(31.90，88.98)55.75(40.62，80.05)69.52(41.23，84.32)0.4520.637 INS180(IU/L)22.00(11.70，36.36)26.05(13.74，38.79)24.63(15.77，45.25)0.0740.929 ISI0.024(0.015，0.035)0.016(0.013，0.022)0.014(0.009，0.022)1.4720.234 IRI1.87(1.28，3.03)2.75(1.96，3.53)3.16(2.01，4.83)5.9280.003 AUC216.64±149.22195.02±73.61213.41±86.640.3770.687 FPG(mmol/L)4.95(4.69，5.22)4.98(4.67，5.18)5.03(4.70，5.25)0.8040.443

2.4 后移组三种基因型各指标比较 见表5。单因素方差分析显示，后移组三种基因型的Fins和ISI差异有统计学意义（F=3.827，3.559，P=0.027，0.034），相比于CC型，CT型和TT型的Fins升高，而ISI降低（t=2.11～2.51,P=0.015～0.039）。其余时间点的胰岛素水平、AUC和FPG差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表5 后移组三种基因型各指标的比较[ ±s或M（P25，P75）]

表5 后移组三种基因型各指标的比较[ ±s或M（P25，P75）]

项 目CC基因型（n=24）CT基因型（n=26）TT基因型（n=15）FP Fins(IU/L)8.67(6.73，10.66)13.00(9.29,20.74)13.92(7.84，18.03)3.8270.027 INS30(IU/L)72.08±49.6072.29±62.8693.53±75.580.6930.504 INS60(IU/L)63.74(41.38，173.56)75.41(18.23，149.51)98.81(50.62，244.36)0.9410.396 INS120(IU/L)101.08(66.56，206.04)109.51(42.09，244.18)152.21(72.29，247.67)0.3630.696 INS180(IU/L)60.15(34.83，101.59)52.52(21.97，96.64)52.48(21.24，84.95)0.5860.560 ISI0.022(0.018，0.033)0.016(0.010，0.023)0.014(0.011，0.025)3.5590.034 IR2.04(1.38，2.49)2.91(2.01，4.50)3.16(1.77，3.99)2.7480.072 AUC295.29±197.45299.43±234.86360.61±257.030.4480.641 FPG(mmol/L)5.03(4.57，5.53)4.89(4.68，5.12)4.90(4.51，5.36)0.8670.425

3 讨论

正常情况下，IRT峰值时间在30或60min，即胰岛素峰值在第一分泌时相，在短时间高糖刺激下，机体能够快速、有效地分泌足够量的胰岛素；若IRT峰值时间延迟到120或180min，即为胰岛素峰值后移，提示第一分泌时相胰岛素分泌不良，未能将血糖下降至合适水平，第二分泌时相持续高水平分泌胰岛素以控制血糖水平。第一分泌时相分泌不良是β细胞功能受损的病理生理学特点，是糖耐量异常和餐后血糖异常升高的重要原因[10-11]。既往研究表明在发生峰值后移的人群中，即便是糖耐量正常，其胰岛功能已经处于早期受损阶段，发展为2型糖尿病的风险高[12]，因此探讨胰岛素峰值后移的影响因素，对糖代谢异常的早期防治有一定的临床价值。

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T基因是位于染色体1p36.3的第677个核苷酸，其等位基因C可向T发生突变，产生三种基因型：突变纯合型（TT）、突变杂合型（CT）以及野生型（CC）。王玲玲等[13]研究表明在妊娠糖尿病孕妇中等位基因T的频率显著高于正常孕妇组，而且MTHFR代谢过程中的中间产物同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平也同步升高，证明该位点突变导致Hcy水平升高是妊娠糖尿病发生的重要危险因素。本研究结果表明MTHFR C677T基因对糖代谢异常的影响在早期阶段就已经存在，胰岛素峰值后移组的基因型分布和T等位基因频率与无后移组相比，CT型和TT型占比更高，等位基因T的频率亦高于无后移组，两者差异均有统计学意义，提示该基因多态性对胰岛素峰值后移有影响，T 等位基因可能是胰岛素峰值后移的易感基因。

多囊卵巢综合征（PCOS）患者无论是否发生胰岛素峰值后移，三种基因型Fins单因素方差分析均有统计学意义，两组CT型和TT型的Fins均高于CC型,MTHFR C677T基因C向T突变对Fins有影响，可使Fins升高。Fins异常是空腹血糖调节受损主要的病理机制，糖代谢异常患者Fins显著高于正常人群，同时Fins升高也对PCOS患者病情控制不利，需要引起足够的重视[14-15]。两组组内不同基因型之间比较，饮用糖水后的其他时间点血清胰岛素水平，AUC和FPG差异均无统计学意义，基因型不同对高糖刺激下单个时间点胰岛素分泌量和IRT试验全过程胰岛素分泌总量并不影响，对FPG亦无影响。总体上看，MTHFR C677T基因位点突变可影响基础胰岛素水平，但对胰岛素的反应能力和胰岛素分泌总量没有影响，也尚未对FPG构成影响。

在未发生胰岛素峰值后移的PCOS患者中，CC型、CT型、TT型的患者IRI呈递增趋势，LSD-t检验 CT型、TT型与CC型比较，差异均有统计学意义，C向T突变使未发生峰值后移的PCOS患者胰岛素抵抗程度增加。该位点突变可使MTHFR的活性及其耐热性下降，叶酸摄入量不足时，Hcy水平升高，进而导致胰岛素抵抗程度增加，血糖升高的风险也随之增加[16-18]。胰岛素抵抗本身是PCOS重要的致病机理，50%～70%的PCOS患者存在胰岛素抵抗[19]，由此可见MTHFR C677T基因位点突变会加剧PCOS患者的胰岛素抵抗程度。KAO等[20]认为胰岛素抵抗是糖代谢异常的影响因素，胰岛素抵抗使胰岛素对机体组织的生物学作用减弱,胰岛β细胞代偿性地产生更多的胰岛素以维持血糖正常,长时间代偿导致糖代谢异常。但在峰值后移的患者中，不同基因型IRI的差异却无统计学意义。本课题组前期研究表明发生胰岛素峰值后移的PCOS患者IRI比无后移的患者明显增高[20]，因此并非胰岛素后移的患者不存在胰岛素抵抗，而是发展到峰值后移阶段，IRI普遍增高，不同基因型之间的差异不明显。总的来说，对于未发生胰岛素峰值后移PCOS患者来说，MTHFR C677T基因C向T突变使胰岛素抵抗程度增高。

在已发生胰岛素峰值后移的PCOS患者中，不同基因型的患者ISI差异有统计学意义，从CC型到CT型，再到TT型，ISI呈递减趋势，胰岛素敏感性随C向T突变，逐渐降低。ISI是反映了机体靶器官吸收和利用葡萄糖能力的指标，ISI降低提示机体对胰岛素敏感性下降，胰岛素相对不足，糖的摄取和利用减少，也是血糖升高的关键因素之一。胰岛β细胞是根据胰岛素敏感性来调整胰岛素的分泌，胰岛素敏感性下降时分泌增加，胰岛素敏感性增强时分泌减少，动态调整以维持血糖稳定，当这种动态平衡被破坏时，便可发展为糖尿病前期甚至是糖尿病。既往研究表明，胰岛素敏感性逐渐减退与糖代谢异常临床表现加重趋势相符[21]，因此C向T位点突变，可能通过影响机体胰岛素敏感性，增加糖代谢异常的风险。在未发生峰值后移的患者中，不同基因型ISI差异并无统计学意义，疾病发展的不同阶段影响因素可有不同，胰岛素敏感性的改变要晚于胰岛素抵抗[22]，推测胰岛素敏感性改变在胰岛素峰值后移阶段对PCOS患者影响更大，需重视评估峰值后移的PCOS患者ISI，尤其是合并有MTHFR C677T基因突变患者的敏感性可能更低。

综上，PCOS患者MTHFR C677T基因位点多态性与胰岛素峰值后移有关，基因突变患者Fins升高。在未发生峰值后移的患者中，基因突变者抵抗程度增加；而在峰值后移的患者中，基因突变者胰岛素敏感性降低。胰岛素抵抗和高胰岛素血症是糖尿病的始动因素[23]，MTHFR C677T基因位点C向T突变，可使基础胰岛素升高，而在不同时期的胰岛素抵抗程度增加或者敏感性降低，都可能使胰岛素功能降低。当然本研究也有一定局限性：①两个分组TT基因型样本量略少，且研究对象主要集中在佛山地区，MTHFR C677T基因位点多态性有地域上的差异。②本研究仅从探讨MTHFR C677T基因对胰岛素峰值后移的影响，应当看到疾病发生发展的复杂性，仍需综合更多影响因素做进一步研究。