系统性红斑狼疮患者ANA免疫荧光核型分布及其与病情发展的相关性研究

王 娇，杜利君，赵 佳，张 兵（四川省南充市中心医院检验科，四川南充 637000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）属于一种由多种因素所致的自身免疫性疾病，常累及全身多系统、多器官。据统计，全世界的患病率大概是4/10万～25/10万，发病率逐年升高，目前虽然有关SLE的具体发病机制尚不完全明确，但有部分研究证实[1-3]，此病的发生与免疫异常、自身抗体产生有关。临床研究认为[4]，SLE发生后机体免疫失衡，吞噬细胞无法吞噬源自染色体的核酸，从而导致自身抗体异常生成，促进疾病发展，其中以抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）最为常见。ANA是一组针对细胞核内的DNA，RNA，蛋白质或这些物质的分子复合物而产生的抗体，在SLE脏器、组织损伤中具有重要的促进作用[5]。根据临床现有文献已经证实ANA与SLE有关，但鲜少有报道将ANA及免疫荧光核型分布用于病情发展的评估，鉴于此，为弥补ANA在SLE病情发展中的研究空缺及提高临床对SLE病情发展的早期诊断，以我院收治的SLE患者为研究对象，在ANA与SLE有关的结论基础上进一步探讨ANA阳性率及免疫荧光核型是否与患者病情发展有关，以期望为临床上SLE病情发展的研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年8月～2022年8月四川省南充市中心医院收治的SLE患者300例作为SLE组，其中男性63例，女性237例，年龄23～61（43.25±5.50）岁，病程1.0～10（5.76±0.98）年，疾病活动评分（SLEDAI）2～22（15.11±2.88）分；临床表现：红斑69例，光过敏32例，口腔溃疡70例，关节炎78例，浆膜炎45例，肾脏病变38例，血液学疾病59例，免疫学异常64例。选取同期我院收治的非SLE的其他自身免疫性疾病患者50例作为非SLE组，其中男性13例，女性37例，年龄22～61（43.11±4.89）岁；混合型结缔组织病10例，舍格伦综合征13例，类风湿关节炎27例；另外选我院体检的健康人50例作为健康对照组，其中男性14例，女性37例，年龄23～62（43.41±4.94）岁。三组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（χ2=1.606,P=0.448;F=0.039,P=0.962），具有可比性，三组均知情并同意参与此研究。纳入标准：①SLE组符合SLE诊疗指南[6]中关于SLE的诊断标准，符合以下4项或4项以上即可诊断，⑴峡部红斑；⑵盘状红斑；⑶光过敏，对日光有明显反应，引起皮疹；⑷口腔溃疡；⑸非侵蚀性关节炎，累及两个或更多的外周关节；⑹浆膜炎（胸膜炎或心包炎）；⑺肾脏病变（尿蛋白＞0.5g/24h或管型）；⑻神经病变（癫痫发作或精神病）；⑼血液学疾病（白细胞减少、淋巴细胞减少或血小板减少、溶血性贫血）；⑽免疫学异常。②非SLE组患者均经临床确诊。③健康对照组各项检查均正常，身体健康。④年龄≥18岁。⑤自愿参与。排除标准：①肝功能、肾功能严重衰竭者；②并发局部感染或全身无法控制的感染疾病者；③妊娠或哺乳妇女；④良恶性肿瘤者；⑤代谢严重紊乱者。

1.2 仪器与试剂 Lminex®仪器（Bio-Techne Corporation公司），ANA谱检测试剂盒（宙斯科技公司），ANA试剂盒[欧蒙（德国）医学诊断实验公司]。

1.3 方法

1.3.1 ANA阳性率及ANA免疫荧光核型检测：采集所有研究对象3ml空腹静脉血，在3 500r/min下离心分离出血清，放置于-20℃下保存备用。①采用多重微珠流式免疫荧光发光法检测血清ANA阳性表达情况，严格按照宙斯科技公司AtheNA Multi-LyteTM抗核抗体谱检测试剂盒操作说明于Lminex®仪器上测定，ANA≥100AU/ml定义为阳性。②采用间接免疫荧光（indirect immunofluorescence，IIF）法检测ANA免疫荧光核型，反应板内加25μl血清，与人喉表皮样癌细胞（human laryngeal epidermoid cancer cells，Hep-2）、猴肝片反应30min，加入20μl异硫氰酸荧光素结合的抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），在显微镜下观察Hep-2核荧光染色情况，报告ANA免疫荧光核型。

1.3.2 疾病活动指数评价：使用系统性红斑狼疮活动指数（systematic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）评分评价疾病活动情况，共24项，得分范围为0～105分，SLEDAI≥5分定义为疾病处于活动期，＜5分定义为疾病未处于活动期，根据患者疾病进展情况分为SLE活动组（n=111）、SLE非活动组（n=189）。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0统计软件作为数据分析工具。计量资料服从正态分布并以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用n（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用多因素Logistic回归分析影响SLE患者病情发展的危险因素；采用Spearman检验分析ANA与SLE患者病情发展的相关性；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析ANA及Logistic回归模型预测活动性SLE的价值。P＜0.05为差异具有统计学意义。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 三组ANA阳性表达率及SLE患者ANA免疫荧光核型分析 SLE组ANA阳性率为96.00%（288/300），高于非SLE组[56.00%（28/50）]和健康对照组[4.00%（2/50）]，差异具有统计学意义（χ2=78.184，P＜0.05）。288例ANA阳性SLE患者免疫荧光核型包括核颗粒型[60.07%（173/288）]、核均质型[31.94%（92/288）]、胞浆颗粒型[3.47%（10/288）]、核仁型[2.78%（8/288）]和着丝点型[1.74%（5/288）]，以核颗粒型最为多见，其次为核均质型。

2.2 ANA与SLE患者临床特征、病情发展的关系 关节炎阳性、SLE活动期患者ANA阳性率高于关节炎阴性、SLE非活动期患者，差异具有统计学意义（均P＜0.05），与其余特征资料无关（均P＞0.05）。见表1。根据SLE患者病情发展情况分为SLE非活动组和SLE活动组，分析两组ANA免疫荧光核型发现，与SLE非活动组比较，SLE活动组核颗粒型比例升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；两组ANA免疫荧光核型核均质型、胞浆颗粒型、核仁型、着丝点型对比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 ANA与SLE患者临床特征、病情发展的关系[n（%）]

表2 SLE非活动组、SLE活动组ANA免疫荧光核型比较[n（%）]

2.3 SLE非活动组、SLE活动组SLE患者临床资料对比 见表3。SLE活动组肾脏病变占比、SLEDAI评分、IgA，IgM和IgG水平均高于SLE非活动组，C3，C4水平均低于SLE非活动组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 SLE非活动组、SLE活动组SLE患者临床资料对比[（±s），n（%）]

表3 SLE非活动组、SLE活动组SLE患者临床资料对比[（±s），n（%）]

类 别SLE非活动组（n=189）SLE活动组（n=111）t/χ2P性别（男/女）39/15024/870.0410.839年龄（岁）43.29±5.5843.20±5.370.1330.894病程（年）5.79±0.975.72±1.000.5750.565 SLEDAI评分（分）2.10±0.4315.64±3.4253.8190.001 IgA（mg/L）1.98±0.234.98±0.7650.1090.001 IgM（mg/L）1.03±0.123.00±0.2396.7510.001 IgG（mg/L）13.42±2.5120.08±4.5316.3980.001 C3（mg/L）1.15±0.210.60±0.0925.9910.001 C4（mg/L）0.49±0.100.20±0.0527.7250.001临床表现 红斑46（24.34）23（20.72）0.5170.472光过敏20（10.58）12（10.81）0.0040.951口腔溃疡45（23.81）25（22.52）0.0650.799关节炎50（26.46）28（25.23）0.0550.815浆膜炎25（13.23）20（18.02）1.2590.262肾脏病变40（21.16）43（38.74）10.7930.001神经病变23（12.17）19（17.12）1.4220.233血液学疾病39（20.63）20（18.02）0.3030.582免疫学异常37（19.58）27（23.32）0.9390.332

2.4 影响SLE患者病情发展的因素及ANA与SLE患者病情发展的相关性分析 以SLE患者病情发展状况作为因变量，病情活动=1，非活动=0，将表2，表3筛选有意义的变量作为自变量，行二元Logistic回归分析，结果显示，ANA阳性、ANA核颗粒型、SLEDAI评分、IgA，IgM，IgG，C3，C4和肾脏病变等均是影响SLE患者病情发展的独立危险因素。见表4。进一步分析ANA与SLE患者病情发展的相关性发现，ANA与SLE患者病情发展呈正相关（r=0.309，P＜0.05）。见图1。

图1 ANA与SLE患者病情发展的相关性

表4 SLE患者病情发展的因素分析

2.5 ANA及Logistic回归模型预测活动性SLE的价值分析 针对Logistic回归分析所获得的因素，建立预测模型，即Logit（P）=1.854×（ANA阳性）+1.872×（ANA核颗粒型）+1.278×（SLEDAI评分）+1.651×（IgA）+1.795×（IgM）+1.885×（IgG）+1.684×（C3）+1.463×（C4）+1.221×（肾脏病变）-10.797。经ROC曲线分析显示，相比单独使用ANA，由Logistic回归分析结果所获得的预测模型对活动性SLE的预测价值更高（曲线下面积=0.895，95%CI：0.800～0.943，P＜0.05）。见表5，图2。

图2 ANA及Logistic回归模型预测活动性SLE的ROC曲线

表5 ANA及Logistic回归模型预测活动性SLE的效能分析

3 讨论

系统性红斑狼疮（SLE）的发生与免疫系统紊乱相关，目前世界范围内SLE的发病率逐年升高，既往研究发现，SLE起病缓慢，早期仅表现为关节痛、皮疹，无明显组织器官损伤，但随着病情的进展，患者逐渐从原有的关节痛、皮疹转变为狼疮肾病、中枢神经损伤，甚至狼疮危象，严重威胁着患者生命安全[7-9]。就目前研究发现[10]，SLE患者病情发展可从多个方面综合评估，一方面从疾病活动度，反映了脏器的急性可逆性损伤，另一方面可从脏器、组织受累损伤情况以评估。虽然SLE目前无法治愈，但临床可通过早期预测患者病情发展状况，制定针对性的措施，以控制病情恶化，因此早期评估病情发展对改善患者预后具有重要的意义。

由于SLE自然病程多表现为病情加重与缓解交替，仅根据患者临床表现难以早期诊断，需借助生物学指标进行诊断，既往研究显示[11]，SLE患者血清中存在较多的自身抗体，这些抗体与自身抗体结合后形成大量的免疫复合物，从而激活补体系统，进而形成炎症损伤，加速病情发展。ANA是一组细胞核内DNA，RNA及蛋白等分子复合体所产生的自身抗体类型，主要存在于IgG内，可识别细胞核组分，在多种自身免疫性疾病患者中均可检出ANA[12]。研究发现[13]，SLE患者多存在以ANA阳性为表象的自身免疫功能紊乱表现，表明ANA可能参与SLE发病，可能与DNA损伤、细胞凋亡坏死、氧化应激有关。在本研究中比较SLE组、非SLE组及健康对照组ANA阳性表达情况，结果发现，与非SLE患者、健康人比较，SLE患者血清ANA阳性率显著升高，此结果与邹红云等[14]研究结果相似，此结果说明ANA与SLE关系密切，证实了ANA在SLE中的广泛表达，分析其原因可能为SLE中DNA损伤、细胞凋亡坏死、氧化应激等病理改变所致。另外研究显示[15]，SLE的临床表现复杂多样，且伴随着多器官系统损害，其中以肾脏损害最为常见。鉴于此，本研究进一步分析ANA在SLE患者不同临床特征中的表达差异，结果显示，存在关节炎的患者ANA阳性率明显高于无关节炎患者，但存在肾脏损害的患者虽然ANA有所升高，但升高并不显著，此结果提示着，虽然SLE患者存在多器官系统损害，有关节炎的患者ANA阳性显著升高，但与肾脏损害无明显相关，我们推测可能与本研究所纳入样本量较少有关，后续还需扩大样本量进一步分析。另外本研究根据SLE病情发展情况，分为SLE非活动期和SLE活动期，分析ANA与患者病情发展的关系，结果显示，处于SLE活动期的患者ANA阳性率显著升高，此结果提示着，ANA可能参与SLE病情发展，但本研究尚未深入分析其具体机制，推测可能为SLE病情发展过程中，机体DNA损伤加剧，从而导致ANA阳性率升高。

目前随着临床上对SLE的深入研究发现[16-17]，当病情发展时，患者免疫抑制现象加重，T细胞失调加剧，导致大量ANA产生，进而增加免疫复合物沉积量，损伤器官。刘卫霞等[18]在其研究中发现，ANA荧光核型分析有利于SLE的诊断和治疗。报道显示[19]，ANA的靶抗原成分较多，如细胞骨架、胞核、胞浆等，核颗粒型与SLE患者疾病活动存在一定的关联，核颗粒型更加趋向于症状缓解。另外ANA免疫荧光核型核均质型所对应的靶抗原主要为核小体、组蛋白、DNA等细胞核成分，而在SLE发生后细胞凋亡加剧，大量核小体活性增加，髓系树突状细胞以自身抗原形成呈递，此时T细胞经激活B细胞产生ANA，进而引起器官、组织损伤[20-21]。同时ANA抗原性增加后诱导补体活化，促进细胞炎症浸润，过量的细胞因子被释放，炎症级联进而加重器官、组织损伤[22-23]。许晓风等[24]学者在其一项报道中发现，SLE患者ANA免疫荧光核型多为胞浆混合型、核均质型，不同ANA免疫荧光核型患者症状不同。本研究通过分析SLE患者ANA免疫荧光核型分布特征发现，患者ANA免疫荧光核型以核颗粒型最为多见，且处于活动期的患者核颗粒型比例更高，此结果说明，ANA免疫荧光核型核颗粒型可能参与患者病情发展，分析其结果可能与部分患者在疾病进展时，细胞凋亡增加，核小体活性增加，补体活化，对组织损害程度加重，进而表现为ANA免疫荧光核型分布一致化。

抗核抗体（ANA）对SLE或其他自身免疫性疾病的早期诊断和鉴别具有一定的指导意义，大多数SLE患者表现为ANA阳性，但ANA滴度与SLE进程并非是平行的，在诊断患者病情发展时可能存在一定差异。因此需要采用多种临床指标联合检测并结合临床症状，可较准确地判断疾病进展、活动性与非活动性变化情况，有助于对疾病的治疗和转归进行评定，本研究中根据Logistic回归分析结果，联合ANA构建预测患者病情发展的模型，结果显示，与单独ANA预测相比，所构建的模型预测效能更优，此结果提示着，临床在评估SLE患者病情发展状态的同时，还需结合临床治疗和症状表现，以提高评估准确率。

综上所述，SLE患者ANA免疫荧光核型主要以核颗粒型为主，ANA阳性是导致患者病情发展的重要因素，监测ANA表达及免疫荧光核型有助于SLE病情发展的诊断和评估。本研究分析ANA及免疫荧光核型与SLE患者病情发展的关系及ANA对SLE的预测价值，在临床上具有一定的推广价值。但本研究并未进一步验证ANA及免疫核型参与SLE患者病情发展的具体机制，因此后续还需进一步深入探究。