NOD1mRNA调节Th1/Th2和Treg/Th17细胞因子在肺结核中的免疫机制及预后价值研究

张兆明，陈素丽，姬 玉，李雪燕，田 月（昌吉市人民医院医学检验科，新疆昌吉 831100）

结核病（tuberculosis）是一类由结核分枝杆菌感染引起的，具有传染性强、病情易反复且以肺部感染最为常见[1-2]的传染性疾病。数据显示，我国新疆地区为结核病的高负担地区，结核病发病率（195.8/10万）及死亡率均居全国首位[3]。目前认为T细胞介导的细胞免疫在结核病发病机制中有至关重要的作用。其中CD4+的T淋巴细胞群是发挥抗结核免疫的关键细胞，可以通过进一步分化为辅助性T细胞1 (Th1)、辅助性T细胞2(Th2)、辅助性T细胞17(Th17)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg )等发挥其免疫协调作用。核苷酸结合寡聚化结构域1(nucleotide binding oligomerization domain1，NOD1）是一种重要的模式识别受体，目前关于NOD1与结核病的研究仅有少量报道[4-5]。虽有多项研究分析了健康者、肺结核患者治疗前后Th1/Th2，Th17/Treg平衡的变化情况，以及从Th1/Th2，Th17/Treg平衡角度研究结核病诊断、进展和治疗的相关靶点或药物[6-7]，但是其作用机制是否与调节免疫功能有关，尚不清楚。基于国内外多项研究，本项目组提出科学假说：NOD1可能通过调节Th1/Th2，Th17/Treg平衡参与肺结核细胞免疫进展过程。为验证此假说，本项目拟通过临床收集肺结核患者和健康体检者100例临床样本，最终分析NOD1mRNA与Th1/Th2，Th17/Treg细胞因子表达之间的差异和相关性，为后续NOD1在结核分歧杆菌感染的机制研究方面提供实验基础，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2021年7月～2022年7月昌吉市人民医院结核病门诊收治的肺结核患者50例为研究对象，其中男性29例(58.0%)，女性21例（42.0%），年龄23～58（38±6.7）岁。纳入标准：①须符合国内肺结核指南诊断标准《中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断WS288-2017》；②经CT，X线、病理检查确诊为肺结核患者；③首次确诊、既往5个月未服用免疫抑制剂或激素。排除标准：①并发慢性肺炎、哮喘性疾病、慢阻肺等肺部疾病；②既往有肺部手术史；③并发心、肝、肾等重大脏器疾病；④存在意识或精神障碍不能与患者取得良好配合者；⑤孕妇及哺乳期妇女。并选择该院同期门诊就诊的健康体检者50例作为对照组。男性31例(62.0%)，女性19例(38.0%)，年龄22～49（24±5.8）岁。两组一般资料年龄、性别等比较，差异无统计学意义（t=3.51，χ2=12.11，均P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象对本研究知情同意,并签署知情同意书。入组肺结核患者进行常规抗结核治疗，定期来院领药或者电话随访，随访截止日期以2023年2月止。

1.2 仪器与试剂 运用Trizol法进行NOD1总RNA的提取，RT-PCR反应体系(南京诺唯赞生物科技公司)。实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)上下游引物由上海生工生物工程有限公司合成，各细胞因子检测试剂盒(上海语纯生物科技有限公司)。荧光定量PCR扩增仪(西安天隆科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本收集：所有研究对象空腹采集静脉血两管，1管采集于EDTA-K2抗凝管中，并于采集后尽早进行单个核细胞分离，NOD1总RNA的提取。另一管则采集于非抗凝黄头管中，3 000r/min离心10min，分离的血清置于-80℃以下保存。肺结核组收集抗结核治疗前、抗结核治疗3个月和治疗6个月的标本。

1.3.2 外周血单个核细胞分离：将全血使用PBS稀释混匀后，在一次性无菌离心管中加入含有与血液相同体积的淋巴细胞分离液，室温2 000 r/min离心20 min后，弃上清，离心结束后整个体系分为肉眼可见的4层，上层为血浆和血小板成分，中层为分离液，上层和中层界面之间是以外周血单个核细胞为主的白膜层成分，最下层为白细胞和红细胞成分。使用加样枪小心缓慢吸取白膜层细胞，再用PBS冲洗2遍，收集细胞沉淀物。

1.3.3 总RNA的提取：采用Trizol法提取外周血单个核细胞总RNA，在所提取的单个核细胞中加入500μl Trizol裂解液,按照说明书步骤进行总RNA的提取，最后室温干燥晾干，加入无Rnase的水溶解RNA，放-80℃保存备用。

1.3.4 cDNA的逆转录：利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，严格按照试剂说明书进行。逆转录反应体系：RNase-free dd H2O 16μl,4×g DNA wiper Mix 4μl,模板RNA 2μl,移液器吹打混匀，42℃2min，后取反应液16μl，加入4μl的5×HIScriptⅢqRT superMix 混匀后上机进行逆转录反应，逆转录反应参数，37℃15min，85℃5s。

1.3.5 实时荧光定量qPCR：以产物cDNA为模板进行qPCR扩增。设计选择NOD1引物，引物参数见表1。qPCR体系包括：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl，Primer1(10μmol/L)0.5μl，Primer2(10μmol/L)0.5μl，模板cDNA 2μl，ddH2O 7μl混匀离心后，进行qPCR反应，反应参数：预变性95℃30s，一个循环。95℃5s，60℃10s 40个循环，降温95℃15s，60℃60s，95℃15s 1个循环。目的基因设置空白对照。上述实验设置三个平行实验，取Ct值均值。Ct值与加入的cDNA模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，加入的起始模板浓度越高，Ct值越小，起始模板浓度越低，Ct值越大。根据目的基因的相对定量结果，以GAPDH内参基因对目的基因进行标化，在Excel表中采用2-ΔΔCt法分析NOD1在各组间的相对表达情况。

表1 NOD1引物参数列表

1.3.6 ELSIA方法检测血清Th1/Th2,Th17/Treg细胞因子IFN-γ，IL-4，IL-10和IL-17的表达水平：具体实验步骤按照试剂说明书进行，酶标检测仪在450nm波长下测定吸光度值（A），绘制标准曲线，在Excel 表中，横坐标为标准品浓度，纵坐标为对应A值，绘制标准品线性回归曲线，根据测得样本A值，在标准曲线中计算样本浓度。

1.4 统计学分析 运用Spss26.0软件进行数据处理。所得数据计量资料首先进行正态分布检验，符合正态分布检验后采用两独立样本t检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示。非正态分布数据采用秩和检验，计量资料以中位数（四分位数[M（P25～P75）]表示。多组间的比较采用单因素方差分析比较。采用Pearson相关性分析，多因素COX回归分析影响肺结核患者短期预后的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组检测指标比较 见表2。采用RT-qPCR检测NOD1的表达水平，ELISA法检测细胞因子IFN-γ，IL-4，IL-10和IL-17的表达水平。NOD1，IFN-γ和IL-17水平在肺结核组均低于对照组；IL-4和IL-10水平在肺结核组均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组检测指标比较[±s，M（P25～P75）]

表2 两组检测指标比较[±s，M（P25～P75）]

项 目对照组肺结核组（治疗前）t/U值P值NOD10.95±0.4410.87±5.2944.86＜0.05 IFN-γ（pg/ml）5.40±0.363.91±0.5216.58＜0.05 IL-4（pg/ml）10.44±0.5917.23±4.77-9.97＜0.05 IL-10（pg/ml）24.17±2.8829.17±2.07-9.89＜0.05 IL-17（pg/ml）33.35（29.77～35.10）28.93（27.57～31.03）-5.79＜0.05

2.2 肺结核组抗结核治疗前后各指标比较 见表3。观察规范抗结核治疗后的3个月及6个月与治疗前相比较指标的差异。结果显示，与治疗前相比，NOD1，IL-4，IL-10治疗3个月和6个月表达水平显著下降，差异均有统计学意义（t=-17.03，2.46，5.51，-26.51，9.47，10.13，均P＜0.05)。治疗前相比，IL-17，FN-γ治疗3个月和6个月的表达水平显著升高，差异均有统计学意义（t=-5.28，-3.45，-13.81，-4.34，均P＜0.05)。所有病例接受抗结核治疗后效果良好，治疗6个月后与健康对照组比较，差异均无统计学意义（t=-1.01，-0.83，1.73，-1.24，均P＞0.05）。

表3 肺结核组抗结核治疗前后各指标比较[±s，M（P25～P75）]

表3 肺结核组抗结核治疗前后各指标比较[±s，M（P25～P75）]

项 目治疗前治疗3个月治疗6个月FP NOD10.87±5.296.11±3.911.06±0.96-17.03＜0.05 IFN-γ（pg/ml）3.91±0.524.45±0.515.32±0.51-5.28＜0.05 IL-4（pg/ml）17.23±4.7715.20±3.3910.72±0.942.46＜0.05 IL-10（pg/ml）29.17±2.0726.36±2.7024.12±2.685.51＜0.05 IL-17（pg/ml）28.93（27.57～31.03）29.67±3.6531.52±5.03-3.41＜0.05

2.3 NOD1表达与细胞因子IFN-γ，IL-4，IL-10和IL-17相关性比较 Pearson相关性分析表明，NOD1水平与IFN-γ，IL-10水平呈正相关（r=0.514，0.421），与IL-4水平呈负相关（r=-0.363），差异具有统计学意义（均P＜0.05）；与IL-17水平无明显相关性（r=0.125，P＞0.05)。

2.4 NOD1及Th1/Th2/Treg/Th17细胞因子对肺结核患者的短期预后研究 见表4。多因素COX回归分析影响肺结核患者短期预后的危险因素，以肺结核患者短期预后状态为应变量，赋值1=治愈，0=未治愈。以年龄、性别、NOD1，IFN-γ，IL-4，IL-10，IL-17为协变量。COX回归分析表明：NOD1mRNA的表达≥10.87，IFN-γ≥3.90pg/ml是影响肺结核患者短期预后的危险因素。

表4 多因素COX 回归分析影响肺结核短期预后的危险因素

3 讨论

肺结核 (TB)是世界范围内最重要的传染病。2022年10月27日，WHO发布了最新的《2022年全球结核病报告》[8]，2021年全世界有新发肺结核患者1 060万例，肺结核发病率上升了3.6%。控制结核病感染仍然是发展中国家的主要任务。目前临床研究发现肺结核患者治疗的周期长、效果慢、费用高，患者经治愈后易复发，且容易导致药物对结核分枝杆菌产生耐药性[9]。在肺结核的发病机制中，适应性免疫在原发性肺结核及其再激活中发挥着关键作用，结核分枝杆菌活动性感染可引起高度反应性的免疫应答，产生特异性或非特异性的细胞因子以根除感染[10]。在所评价的细胞因子中，IFN-γ和TNF-α是控制结核分枝杆菌感染的关键，它们有助于先天性免疫细胞如单核细胞和粒细胞的募集和活化以及T淋巴细胞的细胞毒活性的激活。各细胞因子水平之间的平衡对于解决结核分枝杆菌感染或结核病进展至关重要。有证据表明，促炎环境中Th2应答的激活导致细菌增殖和疾病进展[11-12]，Th1免疫反应诱导巨噬细胞抗微生物活性的激活[13]。细胞因子产生的缺陷被认为是结核分枝杆菌感染和结核病进展的危险因素[14]。并且结核分枝杆菌可以操纵宿主的免疫系统，调节抗原的加工，造成效应免疫反应的不平衡，均与细胞因子的产生有关[15]。

此外，结核分枝杆菌部分可通过调节改变Th细胞的平衡来逃避宿主的免疫应答[16]。正常情况下，Th1/Th2细胞相互调节，维持免疫系统正常运转，其中Th1可介导细胞免疫，清除病原体并诱使免疫细胞浸润，而Th2分泌IL-4，IL-10等细胞因子介导体液免疫，能够清除抗原并发挥抗过敏作用[3]。李奇凤等[17]研究发现结核病患者体内Th1细胞、Th2细胞免疫应答情况，结果显示结核病患者Th1细胞含量下降，Th2细胞含量升高，Th1/Th2细胞比例失衡，提示异常增高的Th2以及Th1细胞被抑制，无法对机体起到保护性作用，导致了结核病的进展。Th17及Treg细胞是近年来发现的新型免疫细胞，两者相互抑制。其中Th17是一种以分泌IL-17，IL-22等细胞因子为主的T细胞亚群，能够诱导多种前炎症细胞因子和趋化因子的产生。而Treg细胞则能够分泌TGF-β，IL-10等细胞因子发挥免疫抑制作用[18]。有学者发现，肺结核患者Th17细胞数量和IL-17的表达降低，Treg细胞数量和IL-10的表达升高，且这种趋势与肺结核患者病灶数目、直径总和以及空洞形成密切相关[19]。武忠长[20]研究证实了肺结核患者Th17细胞表达率降低，Treg细胞表达率升高，经6个月抗结核治疗后Th17/Treg比值明显高于治疗前，提示Th17/Treg的平衡状态能够影响肺结核病理过程。肺结核患者的Th17细胞比例降低，Th2和Treg细胞比例升高，可能与Th17细胞减少有关[21]。在一项巴西亚马逊人群中肺结核和肺外结核患者的流行病学和细胞因子特征研究中结果显示[22]，不同临床类型肺结核患者血清 IFN-γ水平的AUC值较高，提示IFN-γ水平有助于肺结核与肺外结核的鉴别诊断，促炎细胞因子和抗炎细胞因子水平的失调是结核病发生的危险因素。

LEE等[4]研究认为NOD1基因多态性与不同人群的结核病易感性存在相关性。NOD1广泛表达其水平在免疫细胞、胃肠道和脂肪组织中更为丰富[23]。代谢紊乱患者的脂肪细胞和免疫细胞中NOD1基因表达增加[24]。WANG等[25]通过化学酶法合成了结核分枝杆菌包膜中的一系列肽聚糖片段，发现这些肽聚糖片段能够通过激活NOD1进而刺激机体的免疫系统。同时，有临床研究检测证实了活动性肺结核患者外周血NOD1mRNA水平显著高于潜伏性结核患者和健康体检者，并且在抗结核治疗三个月后NOD1mRNA水平显著降低，在接受6个月抗结核治疗后NOD1mRNA水平已下降至正常水平[6]。以上研究提示NOD1与结核病进展密切相关，并且其作用机制可能与调节免疫功能有关。在T细胞介导的细胞免疫方面，SUAREZ等[26]研究发现，鉴于NOD1在免疫细胞中高水平表达，研究NOD1在免疫细胞浸润和巨噬细胞极化中的作用是有意义的。DENG等[27]将外周血单个核细胞与树突状细胞共培养，结果发现树突状细胞中NOD1和NOD2的激活可诱导外周血单个核细胞中促炎细胞因子的产生和分泌，并且促进了CD4+T细胞的分化和增殖，提示NOD1表达水平在调节Th1/Th2，Th17/Treg平衡中可能扮演了重要角色。NOD1或NOD2的配体可能是有前景的候选配体，因为激活NOD1和NOD2可有效诱导Th1应答[28-30]，并且NOD1和NOD2的激活诱导的识别成分来源于肠道细菌导致促炎和I型干扰素反应[31]。本研究通过RT-qPCR法检测两组研究对象的NOD1mRNA水平，发现在肺结核病例中NOD1mRNA的表达升高。Th1，Th17细胞含量下降，而Th2，Treg细胞含量上升，Th1/Th2的平衡由Th1向Th2方向偏移，Th17/Treg的平衡由Th17向Treg偏移。因此，Th1，Th17细胞被抑制，Th2，Treg细胞被增强，对结核感染的免疫应答产生一定影响，并最终造成结核病的进展。本文研究结果与邢志伟等[6]研究结果一致，NOD1的mRNA的变化与疾病的治疗进展有关。

进一步运用Pearson相关性分析结果表明，NOD1 mRNA水平与IFN-γ，IL-10水平呈正相关，与IL-4水平呈负相关，与IL-17水平无明显相关性，通过相关性分析NOD1可能通过调节Th1/Th2，Treg/Th17的平衡参与肺结核患者细胞免疫进展过程。NOD1 mRNA表达与IL-17无相关性可能与TB感染患者的Th17细胞水平降低，与其程序性细胞死亡有关[22]。在国外，SAINI等[32]通过qRCR比对了皮肤结核组和健康对照组中FOXP3和IL-17，TGF-β的基因表达水平，发现FOXP3与TGF-β呈显著正相关，而IL-17与FOXP3没有任何相关性，推测认为Th17/Treg的平衡分化取决于IL-6，IL-1和TGF-β的平衡。在NOD1及Th1/Th2，Treg/Th17细胞因子对肺结核患者的短期预后的危险因素中发现，NOD1mRNA和IFN-γ的表达增加是影响肺结核患者短期预后的危险因素。二者有望成为预测肺结核患者短期预后的标志物。

综上所述，本文研究分析健康体检者以及肺结核患者治疗前后NOD1mRNA以及Th1/Th2，Th17/Treg细胞因子表达水平，明确NOD1的表达与Th1/Th2，Treg/Th17的平衡具有相关性，在肺结核患者治疗前后，细胞因子指标变化或许和NOD1的表达有关，但引起这种变化的确切机制还需要进一步研究。