绞股蓝珍珠粉胶囊对小鼠睡眠的改善作用

郭文霞, 郭佳琦, 傅容湛

(1. 西北大学化工学院, 陕西 西安 710069 ; 2. 西北大学生物医药研究院, 陕西 西安 710069 ;3. 陕西省医疗器械质量检验院, 陕西 咸阳 712046)

随着社会发展过程中人们生活节奏的加快,睡眠障碍疾病的发生率大大提高[1],全世界因失眠导致的患病率为10%～30%[2-4]。睡眠障碍的主要特征为难以入睡,睡眠时间短,睡眠质量差,睡眠障碍可能引发疲劳、情绪低落、躯体不适和认知障碍等问题[5-7]。目前睡眠障碍常以苯二氮卓等镇静催眠类药物治疗,但连续用药会出现如宿醉、谵妄和共济失调等不良反应[8]。因此,开发具有改善睡眠作用的功能食品备受关注。绞股蓝中的皂苷、多糖和黄酮类化合物是其主要活性成分[9]。绞股蓝皂苷具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、保护肝脏和神经等多方面生物活性[10]。Shen等[11]研究表明,绞股蓝皂苷对小鼠具有镇静、催眠和抗焦虑的作用。《本草纲目》记载,珍珠具有镇静安神、养阴息风、明目消翳和解毒生肌等功效,珍珠粉有治疗惊悸失眠和清肝明目的作用[12]。樊柏林[13]研究发现,酶解珍珠液灌服可使小鼠表现出安静、自发活动减少等现象,能明显延长阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间,还能明显缩短巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期等。

绞股蓝珍珠粉胶囊是以绞股蓝水提物和珍珠粉为原料,经混合、制粒等加工工艺制成的具有改善睡眠作用的功能食品。本试验以小鼠为研究对象,评价绞股蓝珍珠粉胶囊对其睡眠作用的影响,并且对其镇静催眠机制进行初步探讨,为改善睡眠的功能食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 受试物 绞股蓝珍珠粉胶囊,自制(批号:20210508),每粒胶囊含绞股蓝水提物0.202 g(绞股蓝水提得率为18%)、珍珠粉0.080 g。相当于含生药量1.20 g/粒(其中含绞股蓝生药1.12 g,珍珠粉80 mg)。

1.2 实验动物 SPF级昆明小鼠(体重18～22 g),雌性,由陕西省西安市西安交通大学医学部实验动物中心提供[许可证号:SCXK(陕)2018—001]。动物饲养于屏障级动物房,温度20～25 ℃,相对湿度50%～60%,12 h照明和12 h黑暗交替,动物自由摄食和饮水。

1.3 主要仪器和试剂 计时器、玻璃匀浆器和ME104E/02型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品;BioTek全波长酶标仪,美国伯腾仪器有限公司产品;TGL-20台式高速离心机,山东百欧医疗科技有限公司产品。生理盐水、戊巴比妥钠和巴比妥钠,中国医药(集团)上海化学试剂公司产品;五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和多巴胺(Dopamine,DA)酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒,南京建成生物工程研究所产品。

1.4 方法

1.4.1 动物分组和给药 将100只小鼠按照体重随机分为10个组,即9个试验组和1个空白对照组,每组10只。以灌胃方式给予受试药物,灌胃量为0.2 mL/(20 g·bw·d)。空白对照组给予等量的蒸馏水。试验组设置绞股蓝珍珠粉胶囊低、中、高剂量组,分别按120、240和480 mg/(kg·bw)剂量给药;绞股蓝水提物低、中、高剂量组,分别按112、224和448 mg/(kg·bw)剂量给药;珍珠粉低、中、高剂量组,分别按8、16和32 mg/(kg·bw)剂量给药。试验期间动物自由摄食和饮水,每天观察小鼠的活动和生长情况。灌胃30 d后,对各组小鼠进行相关指标的检测。

1.4.2 直接睡眠试验 末次灌胃30 min后观察小鼠睡眠情况,睡眠以翻正反射消失为指标,即当小鼠置于背卧位时,能够立即翻正身位,如果超过60 s小鼠不能翻正,说明翻正反射消失,小鼠进入睡眠,从翻正反射消失到其恢复的时间为小鼠的睡眠时间。分别观察并计算各组小鼠的入睡只数和睡眠时间。如试验组小鼠的入睡只数和睡眠时间增加且与空白对照组相比具有显著差异,即判定该项结果为阳性。

1.4.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 末次灌胃30 min后,各组小鼠腹腔注射戊巴比妥纳45 mg/(kg·bw),以翻正反射消失为小鼠入睡指标,分别记录各组小鼠的平均睡眠时间。

1.4.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 末次灌胃15～20 min后,各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠27 mg/(kg·bw),以翻正反射消失为小鼠入睡指标,分别记录各组30 min内入睡小鼠只数。如试验组小鼠的入睡只数增加且与空白对照组相比具有显著差异,即判定该项结果为阳性。

1.4.5 巴比妥钠睡眠潜伏期试验 末次灌胃15～20 min后,各组小鼠腹腔注射巴比妥钠250 mg/(kg·bw),以翻正反射消失为依据,观察受试药物能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期。如试验组小鼠的睡眠潜伏期与空白对照组相比具有显著差异,即判定该项结果为阳性。

1.4.6 脑组织5-HT、GABA和DA含量的检测 各组小鼠连续灌胃30 d后,禁食12 h,处死小鼠,取出脑组织,用生理盐水冲洗后称其质量,用匀浆器制备10%的脑组织匀浆,4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min后取上清液,按照试剂盒说明书采用 ELISA测定各组小鼠脑组织中5-HT、GABA和DA的含量。

1.4.7 数据处理 用SPSS 21.0软件进行数据转化和统计分析。先对数据进行方差齐性检验,若方差齐,采用单因素方差分析进行总体比较,发现差异再用 Dunnett 法进行多个剂量组与空白对照组均数间的两两比较。若方差不齐,则对原始数据进行适当的变量转换,满足方差齐性检验后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到方差齐的目的,改用秩和检验进行统计,发现总体比较有差异,则采用不要求方差齐性的 Tamhane's T2 检验进行两两比较。

2 结果

2.1 直接睡眠试验 由表1可知,绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物、珍珠粉各剂量组和空白对照组(蒸馏水)的小鼠均未出现睡眠现象(没有翻正反射消失小鼠),提示各组的直接睡眠试验结果皆为阴性。

表1 绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物和珍珠粉对小鼠直接睡眠的影响

2.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 由表2可知,与空白对照组相比,绞股蓝珍珠粉胶囊低剂量组小鼠的戊巴比妥钠睡眠时间显著延长(P<0.01),而中、高剂量组小鼠的戊巴比妥钠睡眠时间极显著延长(P<0.001),说明绞股蓝珍珠粉胶囊可显著延长小鼠睡眠时间。同时,与空白对照组相比,绞股蓝水提物中、高剂量组和珍珠粉中、高剂量组小鼠的戊巴比妥钠睡眠时间显著延长(P<0.05或P<0.01)。结果表明,绞股蓝珍珠粉胶囊各剂量组均可以对小鼠的戊巴比妥钠睡眠时间起到延长作用,且对小鼠睡眠时间的延长作用优于绞股蓝水提物和珍珠粉单药组。

表2 绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物和珍珠粉对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响

2.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 由表3可知,与空白对照组相比,绞股蓝珍珠粉胶囊各剂量组均能显著增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量入睡小鼠只数(P<0.05或P<0.01),而绞股蓝水提物、珍珠粉各剂量组与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结果表明,相较于绞股蓝水提物和珍珠粉单药组,绞股蓝珍珠粉胶囊可以显著增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量入睡小鼠只数。

表3 绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物和珍珠粉对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响

2.4 巴比妥钠睡眠潜伏期试验 由表4可知,与空白对照组相比,绞股蓝珍珠粉胶囊各剂量组均能显著缩短小鼠的睡眠潜伏期(P<0.01或P<0.001),说明绞股蓝珍珠粉胶囊具有缩短巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期的作用。同时,与空白对照组相比,绞股蓝水提物中、高剂量组和珍珠粉中、高剂量组小鼠的睡眠潜伏期均显著缩短(P<0.05或P<0.01)。结果表明,相较于绞股蓝水提物和珍珠粉单药组,绞股蓝珍珠粉胶囊可以显著缩短小鼠的睡眠潜伏期,对小鼠的睡眠起到一定的改善作用。

表4 绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物和珍珠粉对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

2.5 绞股蓝珍珠粉胶囊对失眠小鼠脑组织5-HT、GABA和DA含量的影响 由表5可知,与空白对照组相比,绞股蓝水提物中、高剂量组5-HT和GABA含量显著升高(P<0.05或P<0.01),DA含量显著降低(P<0.01);珍珠粉中、高剂量组5-HT和GABA含量显著升高(P<0.05),DA含量显著降低(P<0.05);绞股蓝珍珠粉胶囊各剂量组小鼠脑组织中 5-HT和GABA含量表现不同程度的增加(P<0.05或P<0.01或P<0.001),DA 含量不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),各指标表现出一定的剂量依赖性关系,且作用效果优于绞股蓝水提物和珍珠粉单药组。由上可知,绞股蓝珍珠粉胶囊对小鼠的改善睡眠作用可能是通过调节小鼠脑组织中的5-HT、GABA和DA的含量实现的。

表5 绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物和珍珠粉对各组小鼠脑组织中 5-HT、GABA和DA含量的影响

3 讨论

5-HT主要是在中枢神经分布并投射广泛,脑内5-HT含量减少会导致机体失眠[14,15]。GABA是中枢神经抑制性递质,它主要是通过与GABA受体(GABAA)特异性结合而发挥镇静、催眠作用[16]。单胺类神经递质DA具有维持觉醒和行为兴奋的作用,其含量的升高可增加觉醒次数,破坏睡眠的完整度[17]。

绞股蓝主要有效成分为绞股蓝总皂苷(Gypenoside,GPS)。徐露等[18]研究发现,绞股蓝总皂苷可以降低正常小鼠的自发活动,还可以加强戊巴比妥钠对中枢神经系统的抑制作用。江砚等[19]研究表明,绞股蓝皂苷可以显著降低大鼠下丘脑内DA和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)含量,还可以增加白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)含量,其改善睡眠机制可能与调节单胺类神经递质有关。珍珠作为一种名贵的中药材,在我国的应用已有几千年的历史。王丽云等[20]研究结果表明,珍珠粉内的色氨酸可能作为其安神镇静成分,通过调节中枢神经系统的兴奋和抑制从而起到催眠作用。潘建新等[21]研究了珍珠对中枢神经系统的抑制作用,指出珍珠粉可以使小鼠脑内5-HT水平升高,进一步发挥改善睡眠的作用。

为了探讨绞股蓝珍珠粉胶囊对小鼠的改善睡眠作用及其可能作用机制,本试验通过延长戊巴比妥钠睡眠时间、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验和巴比妥钠睡眠潜伏期试验观察了绞股蓝珍珠粉胶囊、绞股蓝水提物和珍珠粉对小鼠睡眠的作用,并对小鼠脑组织中的5-HT、GABA和DA含量进行了测定,结果显示绞股蓝珍珠粉胶囊在240 mg/(kg·bw)和480 mg/(kg·bw)剂量下对小鼠的改善睡眠作用明显,此时小鼠脑组织的5-HT和GABA含量与空白对照组相比显著升高(P<0.01或P<0.001),DA水平也显著低于空白对照组(P<0.01)。提示绞股蓝珍珠粉胶囊对小鼠的改善睡眠作用可能是通过5-HT、GABA和DA等多种神经递质的共同调节来实现的。

综上,本试验结果表明,绞股蓝珍珠粉胶囊对小鼠改善睡眠作用良好,其作用机制可能是通过调节小鼠脑中的 5-HT、GABA和DA 含量来发挥改善睡眠的作用,具有一定的临床应用价值。