布替萘芬醇质体的制备和评价

吴海港, 武 娴, 倪 晗, 陈建文, 刘锦妮

(1. 信阳农林学院动物科技学院, 河南 信阳 464000 ; 2. 河南普瑞科伯乐兽药有限公司, 河南 新乡 453400 ;3. 河南省长垣职业中等专业学校, 河南 新乡 453400)

布替萘芬(Butenafine,BTF)是一种高效、低毒的丙烯胺类抗真菌药物,具有较强的抑菌和杀菌效果,并在抗炎方面具有确切效果,临床主要用于治疗敏感菌所引起的足癣、体癣和股癣等真菌性疾病[1-4]。目前,市售BTF制剂主要有凝胶剂、擦剂、乳膏剂和喷雾剂等,凝胶剂和乳膏剂的透皮速率较慢,药物在皮肤中的累积浓度较小[5,6];擦剂和喷雾剂的透皮速率较快,但药物在皮肤表面滞留时间较短,导致其抗真菌效果不理想[7,8]。此外,大多数BTF制剂无法通过角质层渗透进入皮肤。因此,有必要开发新型BTF制剂以提高其治疗效果。

醇质体系统是一种新型柔性纳米脂质体,是由卵磷脂、乙醇和水组成的具有脂质双分子结构的囊泡结构[9,10]。与普通脂质体相比,醇质体结构较稳定、包封率较高、粒径较小,有更好的膜流动性,可增加药物在皮肤局部的累积浓度[11,12]。此外,醇质体本身属于与皮脂相似的类脂,可促使携带药物穿过皮肤角质层到达深层皮肤,是一种良好的皮肤给药载体[13-15],在局部和全身治疗方面具有很好的应用前景。因此,本试验采用乙醇注入法制备布替萘芬醇质体,通过正交试验设计优化处方,确定布替萘芬醇质体的最佳制备工艺,为布替萘芬新制剂的研发提供参考,并为开发透皮给药系统新剂型提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器 HS-17型数显加热搅拌器(上海力辰仪器科技有限公司);JD-1003型电子分析天平(东莞电子仪器设备有限公司);Avanti J-E型高速离心机(Beckman公司);紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Zs90型激光纳米粒径测定仪(Malvern公司);JEM- 1200EX型透射电子显微镜(NEC公司)。

1.1.2 主要药品和试剂 布替萘芬,购自四川明欣药业有限公司;吐温-80,购自天津市科密欧化学试剂有限公司;丙二醇和无水乙醇均为分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司;大豆卵磷脂,购自上海善优生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 布替萘芬醇质体的制备 准确称取大豆卵磷脂50 mg、布替萘芬100 mg、吐温-80 0.1 mL和丙二醇2.0 mL,加入含18 mL无水乙醇的洁净瓶中,(45±1)℃水浴条件下,900 r/min搅拌3 min,充分溶解后用10 mL注射器以1.5 mL/min的速率缓慢匀速滴加适量的蒸馏水(pH 7.0),900 r/min搅拌40 min,0.22 μm微孔膜滤过,即得布替萘芬醇质体,并于4 ℃密封保存。

1.2.2 布替萘芬标准曲线的绘制 称取布替萘芬标准品,用无水乙醇稀释成1、3、5、10、30、50、70和100 μg/mL的系列溶液,在282 nm 处分别测定其光密度(Optical density,OD)值,以布替萘芬质量浓度(X)为横坐标,OD值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.3 包封率的测定 取适量的布替萘芬醇质体溶液,10 000 r/min离心10 min,将100 μL上清液置于10 mL容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度线,按1.2.2标准曲线计算未包封的布替萘芬含量(C),按公式(1)计算未包封布替萘芬的质量,按公式(2)计算包封率(Encapsulation efficiency,EE)。

未包封布替萘芬的质量(m1)=C×V×稀释倍数

(1)

包封率(%)=(m2-m1)÷m2×100%

(2)

其中:V为布替萘芬醇质体的体积;m2为初始制备时加入布替萘芬的质量。

1.2.4 渗漏率的测定 测定布替萘芬醇质体首日的包封率后,在一定条件下保存一段时间后再测定其包封率,按公式(3)计算渗漏率。

渗漏率(%)=(首日包封率-定期测定包封率)÷首日包封率×100%

(3)

1.2.5 正交试验优化布替萘芬醇质体处方 在单因素试验结果的基础上,选择药物与大豆卵磷脂质量比(药脂比A)、无水乙醇与水体积比(醇水比B)、乙醇与丙二醇体积比(乙丙比C)、搅拌温度(D)、搅拌时间(E)、搅拌转速(F)、吐温-80含量(G)为考察因素,以包封率为评价指标,采用(L1837)正交试验表进行试验,因素水平见表1。

表1 正交试验因素和水平

1.2.6 验证试验 按1.2.5中最优处方,平行制备3批布替萘芬醇质体,测定其包封率,计算相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)。

1.2.7 布替萘芬醇质体的质量评价

1.2.7.1 外观和形态特征 将布替萘芬醇质体转移至透明玻璃瓶中,拍照后描述布替萘芬醇质体的外观性状。

1.2.7.2 粒径分布 取布替萘芬醇质体2 mL,在25 ℃条件下采用激光纳米粒径测定仪测定布替萘芬醇质体的平均粒径。

1.2.7.3 形态学观察 将布替萘芬醇质体滴加在铜网上,用2%磷钨酸溶液复染后自然干燥,在透射电镜下观察布替萘芬醇质体的形态。

1.2.7.4 稳定性分析 将布替萘芬醇质体分别在冷藏(4 ℃)和室温(25 ℃)下保存21 d,测定布替萘芬醇质体包封率,并计算其渗漏率;观察布替萘芬醇质体的外观特征,考察其稳定性。

2 结果

2.1 布替萘芬标准曲线的绘制 结果如图1所示,布替萘芬质量浓度与OD值的回归方程为Y=0.020 9X+0.141 1(r=0.999)。

图1 布替萘芬标准曲线

2.2 正交试验优化布替萘芬醇质体处方 结果如表2所示,由极差(R)可知,7个因素对布替萘芬醇质体包封率均有不同程度的影响,按照影响程度由大到小的顺序依次为:醇水比(B)>搅拌温度(D)>药脂比(A)>乙丙比(C)>搅拌时间(E)>吐温-80含量(G)>搅拌转速(F);根据R值和方差分析结果,确定布替萘芬醇质体的最佳制备工艺条件为:A3B3C2D1E2F3G1,即布替萘芬∶大豆卵磷脂为2∶1,无水乙醇∶水为4∶6,乙醇∶丙二醇为9∶1,吐温-80含量为 0.1 mL,搅拌时间为40 min,搅拌温度为45 ℃,搅拌转速为900 r/min。

表2 正交试验结果

2.3 验证试验 按最优处方平行制备3批布替萘芬醇质体,包封率分别为82.55%、81.12%和80.40%,平均包封率为81.36%,RSD为1.09%,表明制备工艺重现性良好。

2.4 布替萘芬醇质体的质量评价

2.4.1 外观和形态特征 布替萘芬醇质体外观为透光、淡黄色、均一稳定的液体,无分层和沉淀现象,可观察到微泛淡蓝色的乳光(图2);光学显微镜下观察,其形态为球形或近球形(图3)。

图2 布替萘芬外观评价

图3 光学显微镜观察布替萘芬醇质体的外观形态(400×)

2.4.2 粒径分布 布替萘芬醇质体的平均粒径为(262.40±2.47)nm,粒径较小,且出现单一的峰波,粒径分布集中,均一性良好(图4)。

图4 布替萘芬醇质体粒径分布

2.4.3 形态学观察 透射电镜观察可见布替萘芬醇质体外形圆整,为双分子层囊泡结构的类球形,且分布较为均匀(图5)。

图5 透射电镜观察布替萘芬醇质体形态(A:20 000×;B:200 000×)

2.4.4 稳定性分析 4 ℃和25 ℃条件下,布替萘芬醇质体样品的平均首日包封率分别为(81.36±1.09)% 和(81.38±1.05)%,21 d后平均包封率分别为(77.62±1.75)% 和(73.09±2.23)%,渗漏率分别为4.60%和10.19%。对布替萘芬醇质体进行形态观察,布替萘芬醇质体呈淡黄色、透明、均一稳定的液体,无明显颜色变化,且无分层和析出现象。

3 讨论

磷脂是构成醇质体的骨架材料,磷脂的性质决定着醇质体囊泡双分子层膜的形成和稳定性。研究表明,采用磷脂酰胆碱含量高的磷脂制备的醇质体囊泡稳定性更好[16]。因此,本试验选择大豆卵磷脂作为醇质体的骨架材料。此外,磷脂的浓度也是影响醇质体的重要因素之一,随着磷脂浓度的增加,醇质体的粒径随之增大,其包封率也将随之增加,但随着醇质体粒径增大,醇质体的渗透性会降低[17]。本试验结果显示,当药脂比为2∶1时,所制备的布替萘芬醇质体为淡黄色透明液体,包封率为81.36%,放置21 d后醇质体状态稳定,无浑浊和沉淀现象。

研究表明,在一定浓度范围内,醇质体的包封率随着乙醇浓度的增加而增加。过低的乙醇浓度会导致醇质体的粒径减少,不利于药物的包封;当乙醇的浓度过高时,会使乙醇和磷脂烃链相互渗透,造成醇质体的双层结构被部分溶解,磷脂的双分子层结构不稳定,进而导致药物渗漏,包封率下降[18,19]。因此,选择合适的乙醇浓度对醇质体的形成和稳定性有十分重要的影响。本试验结果显示,醇水比在4∶6时,所制备的布替萘芬醇质体的包封率和外观形态达到最优状态。乙醇虽然是醇质体的重要组成部分,但乙醇具有加热挥发性,容易导致药物泄露,稳定性差,因此,在生产中可以与其他醇类物质联合应用。丙二醇黏度大,不易挥发,刺激性小,可增加醇质体的稳定性,乙醇与丙二醇合用既可增加药物的溶解度,又可产生显著的促透协同作用,并可改善乙醇挥发性及减轻对皮肤的刺激性[20]。何一鸣等[21]研究表明,当乙醇∶丙二醇的体积比为7∶3时,包封率可达到70%左右。本试验中选取的乙醇∶丙二醇的体积比为9∶1,包封率达到了81.36%。

滴加速度、温度是影响醇注入法制备醇质体的重要因素之一。研究表明,滴加速度过快或滴加速度不均匀将导致膜的流动性增强,加剧薄膜的吸水破裂现象,进而破坏醇脂体的形态结构,降低包封率[22]。搅拌时温度也会影响醇质体的包封率,搅拌时温度过高会使得乙醇挥发过快,卵磷脂还未来得及与乙醇相互融合就已经被高温熔化,出现分层絮状物,从而降低包封率;温度过低不能够达到磷脂固体物质的熔点,会导致包封率降低[23]。因此,本试验选择搅拌温度在45 ℃时,以1.5 mL/min的速率匀速滴加,以保证稳定的包封率和粒径。

表面活性剂能改善醇质体囊膜的流动性,并能抑制醇质体微粒的聚集,从而提高醇质体的稳定性[24]。杨效宇等[25]研究表明,加入少量的吐温-80既可以提高药物的包封率,又可以解决在静置过程中聚集沉淀的问题。本试验结果显示,加入0.1 mL的吐温-80可显著提高布替萘芬醇质体的包封率,这与上述文献报道结果相一致。

本试验采用乙醇注入法制备布替萘芬醇质体,形态均匀,平均包封率为(81.36±1.09)%,平均粒径为(262.4±2.47)nm,且在4 ℃和25 ℃条件下避光放置21 d后,无分层、无沉淀和颜色变化。结果表明,采取乙醇注入法制备布替萘芬醇质体操作易行,包封率较高,稳定性良好,具有较好的应用前景。