血站血液检测实验室ELISA 项目性能验证试验建立与探讨

刘胡敏 陈雪 李文骏 罗颖蓝 梅静(成都市血液中心，四川 成都 610020)

不同试剂在不同血站血液检测实验室使用时存在性能差异，这和实验室的人员、环境、设备性能均有关系。 实验室对自身检测系统的性能评价很重要，尤其应对试剂厂家声明的性能进行验证[1-3]。 对于血站血液检测实验室，如何根据试剂厂家试剂说明书以及相关标准，对酶联免疫检测方法进行性能验证，验证的参数、运用的标本、评价的标准都是需要探讨的内容。 本实验室在ISO15189 体系运行的过程中，将定期对酶联免疫检测方法的性能指标进行分析，现以HCV项目为例，将相关性能验证实验报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1 日常献血者标本 5 份标本(2 份阴性标本，1 份为抗-HCV 弱阳性标本、2 份抗-HCV 强阳性标本)。

1.1.2 标准物质 血清四项标准物质(北京万泰公司，抗-HCV 含量2 NCU/mL，批号:202109009)，抗-HCV 标准物质(北 京 万 泰 公 司， 抗-HCV 含 量 0.05 NCU/mL， 批 号:202012006)，阴性质控品(北京万泰公司，批号:202012009)；抗-HCV 血清盘(北京万泰公司，批号:202012004 2022-12-29)。

1.1.3 室间质评标本 国家卫生健康委临床检验中心10 份(4 份阳性标本，6 份阴性标本)，四川省临床检验中心10 份(6 份阳性标本，4 份阴性标本)，CITIC 室间质评标本30 份(8 份阳性标本，21 份阴性标本)。

1.1.4 脂血标本 参照Ortho-Clinical Diagnostics 公司抗-HCV 检测试剂说明书提出脂质＜10 350 mg/L(11.7 mmol/L)不会干扰检测的要求，获取重脂标本测量其甘油三脂(TG)浓度为13 mmol/L。

1.1.5 溶血标本 参照Ortho-Clinical Diagnostics 公司抗-HCV检测试剂说明书提出血红蛋白(Hb)＜2 000 mg/L(2 g/L)不会干扰检测的要求，用自制溶血标本(Hb 54 g/L)配置游离血红蛋白溶液(Hb 1 977 mg/L)。

1.2 试剂与仪器 抗-HCV 检测试剂(Ortho-Clinical Diagnostics 公司，批号:EXE328；珠海丽珠公司，批号:2021020208)。STAR 全自动加样器、FAME 全自动酶免仪(Hamilton 公司)，URANUS AE288 全自动酶免仪(深圳爱康公司)。 所有仪器设备均符合国家标准，在校验/检定有效期内。 UPS 电源供应，环境温度和湿度符合要求(温度:20 ～25℃，湿度:40%～60%)。

1.3 方法 STAR 加样仪＋FAME 作为1 个检测HCV 项目的系统，进行各类性能参数的验证。 爱康AE288 全自动酶免仪为加样检测一体机，为单独系统。

1.3.1 重复性试验 采用2 种试剂厂家各自提供的阴性、阳性对照，在不低于10 d 试验运行的前提下，进行≥20 次检测。 得到阴性对照检测数据20 个，阳性对照检测数据20个。 预期标准:20 个检测结果不能出现＞1 个阴性或阳性对照不符合生产商要求。

1.3.2 精密性试验 根据《血站技术操作规程》要求:采用接近临界值(S/CO 值2～5)的标本对精密度进行估计。 用2 种抗-HCV 检测试剂对血筛4 项标准物质与抗-HCV 标准物质进行检测。 在同1 酶免板内做20 次重复测试，收集20 个数据评价该试剂批内精密度。 标准物质检测1 次/d，共检测20 d，收集数据评价该试剂批间不精密度。 可接受标准:各检测系统批内不精密度均＜10%，批间不精密度均＜15%。

1.3.3 灵敏度与特异性试验 使用2 种抗-HCV 检测试剂检测抗-HCV 血清盘，进行灵敏度与特异性评价，计算方式见表1:灵敏度:A/(A＋C)×100%；特异性:D/(B＋D)×100%。

表1 灵敏度与特异性试验的方法结果与诊断结果四格表

1.3.4 符合性试验 使用2 种抗-HCV 检测试剂对国家卫生健康委临床检验中心、四川省临床检验中心、CITIC 室间质品进行检测。 可接受标准:检测结果与回馈结果比较，符合率＝(A＋D)/N×100%＞80%。

1.3.5 检出限试验 采用血清4 项标准物质与抗-HCV 标准物质作为定值标本，用阴性质控品做一系列稀释，共稀释4个浓度(0.25、0.5、0.75、1 NCU/mL 与0.062 5、0.125、0.25、0.5 NCU/mL)，用2 种抗-HCV 检测试剂依次检测稀释标本。 选取OD 值与试剂说明书上的Cut-off 值最接近(OD 值≥Cutoff 值)的稀释度，再将该稀释度标本重复进行20 次测试(4份标本/d，测定5 d)。 如果95%以上OD 值≥Cut-off 值，则该稀释度对应标本的浓度即为该检测系统的检出限。

1.3.6 抗干扰能力试验 收集抗-HCV 检测阴性、弱阳性、阳性不同浓度的5 份标本(2 份阴性标本，1 份为HCV 弱阳性标本、2 份HCV 强阳性标本)。 将收集的干扰(溶血、脂血)物质标本加至这5 份标本中(加入干扰物质的量＜样本量的10%)作为实验组，对照组则加入等量的阴性质控品。 用2种抗-HCV 检测试剂对所有标本同时进行检测，每个标本重复检测2 次，计算均值并记录。 接受标准:加干扰物质的阳性组结果和阳性对照组结果之间符合率应≥80%；添加干扰物质的阴性组和阴性对照组结果均为阴性。

2 结果

2.1 重复性试验 见表2。

表2 重复性试验结果

2.2 精密度试验 各系统批内不精密度均＜10%，批间不精密度均＜15%，符合要求，见表3。

表3 精密度试验结果(S/CO)

2.3 灵敏度、特异性及符合性试验

2.3.1 血清盘检测试验 见表4。

表4 血清盘评价符合性结果 (n/n)

2.3.2 室间质评标本检测试验 见表5。

表5 室间质评标本检测结果 (n/n)

2.4 检出限试验 Ortho-Clinical Diagnostics 公司抗-HCV 检测试剂检出限为0.75 NCU/mL，珠海丽珠公司抗-HCV 检测试剂检出限为0.25 NCU/mL，见表6～9。

表6 Ortho-Clinical Diagnostics 公司抗-HCV 检测试剂检出限试验结果(S/CO，＋/-)

表7 Ortho-Clinical Diagnostics 公司抗-HCV 检测试剂连续检测0.75 NCU/mL 标本20 次试验结果

表8 珠海丽珠公司抗-HCV 检测试剂检出限试验结果

表9 珠海丽珠公司抗-HCV 检测试剂连续检测0.25 NCU/mL标本20 次试验结果

2.5 抗干扰能力试验

2.5.1 高甘油三酯实验 加高甘油三酯的实验组结果和对照组的阳性标本结果符合率100%；添加干扰物质的实验组和对照组的阴性标本结果均为阴性，符合接受标准，见表10。

表10 脂血标本抗干扰试验结果检测结果 (S/CO，＋/-)

2.5.2 血红蛋白试验 加高血红蛋白的实验组结果和对照组的阳性标本结果符合率100%；添加干扰物质的实验组和对照组的阴性标本结果均为阴性，符合接受标准，见表11。

表11 溶血标本抗干扰试验结果检测结果 (S/CO，＋/-)

3 讨论

按照ISO15189 医学实验室认可要求，实验室为保证检测结果准确有效，最大程度地保障血液安全，实验室应定期对实验开展的检测项目的各个系统进行性能验证[4-5]。 酶联免疫法的检测系统性能验证内容应根据《血站技术操作规程》和检测试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，通常需要包括:重复性、精密度、灵敏度、特异性、符合性、检出限以及抗干扰性等相关指标。

在各个参数验证中，值得注意的是检测系统的概念。 作为检测量较大的血站血液检测实验室，仪器设备相对较多，那么血站血液检测实验室应根据自身情况，进行检测系统的相对固定。 当检测系统确定后，血站血液检测实验室在制定验证计划时应根据实验室本身使用的试剂选取验证指标和样品。 重复性实验按要求一般采用试剂盒提供的阴阳性对照完成，常规情况下实验≥10 d 且≥20 次检测完成。 这个指标相对易于完成，各个检测系统均应进行验证，本实验室该指标各个系统实验结果均为100%。

精密度实验分批内和批间精密度，从标本易获取、标本稳定性以及溯源性等因素考虑，要求的临界值(S/CO 值2 ～5)标本可以采用商品化的室内质控品，避免S/CO 值过高或过低的标本影响实验结果的情况发生。 精密度的验证能客观反映实验室检测系统的稳定性。 在精度度参数的验证中，本实验室因为仪器设备较多，固定了4 套检测系统，从数据结果中可知，抗-HCV(Ortho)检测的4 套检测系统中，批内精密度最高为6.31%，批间精密度最高10.65%，抗-HCV(珠海丽珠)批内精密度最高为4.97%，批间精密度最高10.74%，总体来说4 套检测系统都较为稳定，检测性能无明显差异，均符合实验室使用需求。

灵敏度、特异性及符合性试验使用了2 种方法进行了验证，其中1 种是采用室间质量评价(PT)标本作为验证方式，但因为每年度各血站血液检测实验室获取的PT 标本数量和标本量有限，实验室指定了1 套系统进行参与室间质量评价相关检测活动，然后将其他系统与这套参加了PT 活动验证的检测系统进行平行比对试验[6-7]，这种模式较为适合检测规模较小的血站血液检测实验室。 而较大的血站血液检测实验室则适合采用检测血清盘的方式并结合检测系统间比对进行性能验证，本实验室验证结果均是100%。

本实验中检出限验证使用的阳性室内质控品作为定值标本，用阴性质控品(血浆)做一系列稀释后进行检测，实验共稀释了4 个浓度，实验室可根据自身情况检出情况进行更多稀释浓度的检测，以获取更接近实验室真实水平的检出限。 需要注意的是这个实验中选择更为接近检出限的质控血清质控品的浓度进行稀释，可以在一定程度上避免高浓度质控血清稀释后不能准确反映稀释后浓度的情况。 试验结果显示珠海丽珠公司试剂检出限为0.25 NCU/mL，Ortho-Clinical Diagnostics 公司试剂检出限为0.75 NCU/mL，基本与以往报道一致[8]。 另外，检出限除了文中使用的方法外，还可以使用国家参考品标本进行评价[9]，而实际工作中只需要选取实验室比较容易实施的方案即可。

抗干扰性的验证，各检测试剂说明书要求并不一致，各血站血液检测实验室可根据自身情况进行验证。 我们采用了5 份标本进行抗干扰试验，实验组和对照组检测值无明显差异。 文中数据显示Ortho-Clinical Diagnostics 公司试剂的抗干扰性能达到说明书声明要求，虽然珠海丽珠公司试剂的说明书未明确提出抗干扰性要求，但同时检测配置的标本，其试剂的干扰能力与与进口试剂无明显差异。

综上所述，以上性能参数的验证实验提示:Ortho-Clinical Diagnostics 公司和珠海丽珠公司的抗-HCV 检测试剂均能在实验室所使用的检测系统中正常运行。 该检测项目在STAR-FAME 检测系统，AE288 检测系统中的重复性、精密性、灵敏度、特异性、抗干扰性均符合使用要求。 在实验室各个检测系统之间，重复性、精密度、灵敏度、特异性、符合性、检出限以及抗干扰性等性能指标国产试剂和进口试剂无明显差异，均处于正常稳定状态。 检测系统的性能验证，能让实验室工作人员对该检测项目的检测系统有个较为全面的认识，能有助于工作人员识别潜在的质量风险，以提高并维持检测系统性能的高水平，从而保证检测结果的稳定性和准确性，最终保证临床用血安全。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。