IgG 抗-AB 对血型抗体效价与胎儿新生儿溶血病患儿血清总胆红素相关性分析的影响*

张怡 程晨 陈怡静 骆群 卓海龙(解放军总医院第五医学中心，北京 100071)

ABO 胎儿新生儿溶血病(ABO hemolytic disease of the fetus and newborn，ABO-HDFN)是1 种免疫介导的溶血性疾病，主要发生于O 型妇女孕产的A 型或B 型胎儿，发生ABO 溶血病的患儿有可能出现不同程度的贫血及高胆红素血症，严重者可导致新生儿胆红素脑病，造成智力低下甚至死亡[1]。因此，及早预测ABO-HDFN 发生的可能性并判定发生高胆红素血症的危险程度，可实现对此疾病的早期干预，避免严重并发症的发生。 O 型孕妇血清中的IgG 类ABO 血型抗体，除了抗-A、抗-B 外，还有抗-AB。 王道琳等[2]研究发现孕妇血清经IgG 抗-AB 吸收后更能准确预测ABO-HDFN 的发生。提示抗-AB 虽然是IgG 性质，但其与ABO-HDFN 患儿血清胆红素之间的关系还有待进一步明确。 因此我们选取北京市血液中心2020 年1—12 月119 例患有HDFN 的新生儿标本进行溶血三项试验和血清总胆红素测定，并收集临床资料。对其母亲血清经IgG 类抗-AB 吸收前后进行抗-A 或抗-B 效价检测，并进一步对母亲血清中IgG 类ABO 血型相关抗体效价水平与血清总胆红素水平相关性进行分析研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1—12 月送检北京市血液中心119 例确诊为ABO-HDFN 的新生儿及其母亲血液标本。 纳入标准:1)符合ABO-HDFN 诊断标准，母亲为O 型Rh(D)阳性，丈夫为A 型、B 型或AB 型Rh(D)阳性；2)母亲及新生儿的临床数据均完整；3)患儿出生后24 h 内发生黄疸，病情呈进行性加重。 排除标准:1)孕周＜34 周；2)存在严重妊娠期并发症的孕妇；3)胎位不正及多胎妊娠；4)患儿合并先天性疾病或凝血功能障碍者。 本研究经本院医学伦理委员会批准(ky-2021-2-2-2)。

1.2 仪器与试剂 二硫苏糖醇(DTT)(批号:202004D08，北京中 科 科 奥)， IgM 单 克 隆 抗-A 或 抗-B 试 剂(批 号:20200310，上海血液生物)，DianaGel Coombs 卡(批号:20016.01.1，基立福诊断)，人ABO 血型反定型用红细胞测定试剂盒(微柱凝胶法)(批号:20054.01，基立福诊断)，Diana 孵育器(DG-SPIN，基立福诊断)，全自动生化分析仪(日立7080，日本)，电热恒温水浴箱(HH-W21，北京市长风仪器)，医用低速离心机(KA2200，KUBOTA 公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG 抗-A 或抗-B 效价检测 取母亲血清200 μL 均分为2 份(样1，样2)，样1不作处理含IgG 抗-AB，样2 用1 mL 压积红细胞(测IgG 抗-A 时用B 型红细胞，测IgG 抗-B 时用A 型红细胞)吸收，室温13 400 g 离心10 min，取上清25 μL 及1%的相应红细胞悬液50 μL 加入微住凝胶卡，37℃孵育15 min 后离心9 min观察结果，验证相应抗体是否已去除。 若未去除重复此操作直至得到不含抗-AB 和抗-B 或抗-A 上清(样3)，样1 和样3分别加入等体积的DTT 溶液，37℃水浴箱孵育30 min。 用生理盐水倍比稀释，使其稀释倍数为1 ∶4，1 ∶8，1 ∶16，1 ∶32，1 ∶64，1 ∶128，1 ∶256，1 ∶512，1 ∶1 024，在微柱凝胶卡中加入25 μL稀释样本及50 μL与新生儿同型的1%红细胞悬液，37℃孵育15 min，离心9 min 观察结果，以凝集强度是±的最高稀释度为IgG 抗-A 或抗-B 效价。

1.3.2 溶血三项试验 采集新生儿静脉血，参照《全国临床检验操作规程》第4 版的方法进行血型与溶血三项试验:直接抗人球蛋白试验(direct anti-globulin test，DAT)，抗体放散试验(erythrocyte antibody eluate test)和游离抗体试验(free antibody test)。 排除不规则抗体后，红细胞抗体放散试验阳性或直接抗人球蛋白试验和游离抗体试验阳性，则可确诊。

1.3.3 血清总胆红素测定 采用全自动生化仪进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行统计分析，计数资料用百分率(%)表示，吸收前与吸收后两组间效价比较采用秩和检验或Fisher 确切概率法。 计量资料用平均数±标准差(±s)表示，吸收前与吸收后各效价水平胆红素呈正态分布且方差齐者多组间比较采用One Way ANOVA 方法分析，不符合者采用Kruskal-Wallis H 检验。 采用Spearman 相关检验分析吸收前与吸收后效价与胆红素的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料与溶血三项试验结果 119 例ABO-HDFN 中，男46 例，女73 例，其中A 型69 例，体重为2.59～4.30 kg，血清总胆红素在61.90～415.99 μmol/L；B 型50 例，体重为2.20～4.49 kg，血清总胆红素在32.70 ～465.00 μmol/L。 DAT、游离抗体试验、释放抗体试验均阳性占13.45%(16/119)；DAT阴性，游离抗体试验、释放抗体试验阳性占51.26%(61/119)；游离抗体试验阴性，DAT、释放抗体试验阳性占1.68%(2/119)；DAT、游离抗体试验阴性，释放抗体试验阳性占33.61%(40/119)。

2.2 A 型ABO-HDFN 患儿母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG 抗-A 效价 比较母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG抗-A 效价采用的方法是秩和检验，吸收前组平均秩次是541.68，吸收后组平均秩次是233.74，P＜0.05。 说明母亲血清经IgG 抗-AB 吸收后抗-A 效价低于吸收前(表1)。

表1 69 名A 型ABO-HDFN 患儿母亲血清IgG 抗-A 效价分布(%)

2.3 B 型ABO-HDFN 患儿母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG 抗-B 效价 比较母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG抗-B 效价采用的方法是秩和检验，吸收前组平均秩次是519.68，吸收后组平均秩次是215.04，P＜0.05。 说明母亲血清经吸收IgG 抗-AB 吸收后抗-B 效价低于吸收前(表2)。

表2 50 例B 型ABO-HDFN 患儿母亲血清IgG 抗-B 效价分布(%)

2.4 ABO-HDFN 患儿母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG抗-A 效价水平对应患儿TBIL 结果的组间比较及IgG 抗-A效价与A 型ABO-HDFN 患儿TBIL 相关性 A 型患儿母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前，IgG 抗-A 效价在各水平上所对应的患儿TBIL 结果没有差异(P＞0.05)；IgG 抗-A 效价与新生儿TBIL 结果无显著相关性(r＝0.181，P＞0.05)；经IgG 抗-AB 吸收后，IgG 抗-A 效价在各水平上所对应的患儿TBIL 结果存在差异(P＜0.05)；IgG 抗-A 效价与新生儿TBIL 结果呈正相关(r＝0.487，P＜0.05)(表3，图1～2)。

图1 IgG 抗-AB 吸收前IgG 抗-A 效价与新生儿TBIL 的相关性分析

图2 IgG 抗-AB 吸收后IgG 抗-A 效价与新生儿TBIL 的相关性分析

表3 69 名A 型ABO-HDFN 患儿TBIL 与母亲血清IgG 抗-A 效价结果

2.5 ABO-HDFN 患儿母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前后IgG抗-B 效价水平对应患儿TBIL 结果的组间比较及IgG 抗-B 效价与B 型ABO-HDFN 患儿TBIL 相关性 B 型患儿母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前IgG 抗-B 效价在各水平上时所对应的患儿TBIL 结果没有差异(P＞0.05)；IgG 抗-B 效价与新生儿TBIL 无显著相关性(r＝0.248，P＞0.05)；经IgG 抗-AB 吸收后IgG 抗-B 效价在各水平上时所对应的患儿TBIL 结果存在差异(P＜0.05)；IgG 抗-B 效价与新生儿TBIL 呈正相关(r＝0.629，P＜0.05)(表4，图3～4)。

图3 IgG 抗-AB 吸收前IgG 抗-B 效价与新生儿TBIL 的相关性分析

图4 IgG 抗-AB 吸收后IgG 抗-B 效价与新生儿TBIL 的相关性分析

表4 50 例B 型ABO-HDFN 患儿TBIL 与母亲血清IgG 抗-B 效价结果

3 讨论

胎儿和新生儿溶血病(ABO-HDFN) 指由于母婴血型不合使得母体内的IgG 类血型通过胎盘， 与胎儿红细胞表面的父源性抗原结合， 使得红细胞致敏破裂产生溶血现象， 造成新生儿不同程度的贫血、黄疸等症状， 严重时可导致死亡[3]。 颜天明等[4]研究显示，O 型血孕妇血清IgG 抗-A(B)效价水平越高，HDFN 的发生率越高。 也有相关报道指出，产妇血清IgG 效价与HDFN 发生无明显相关性[5]。 Ago等[6]通过免疫扩散等技术明确O 型母亲血清中的抗-AB 是1 种具有抗-A 和抗-B 活性的双重特异性的IgG 类。 IgG 抗-AB 既能凝集A 型红细胞，也能凝集B 型红细胞，检测母亲血清中的IgG 抗-A 或抗-B 效价实际是抗-A 或抗-B 和抗-AB 效价，使得IgG 抗-A 或抗-B 效价升高。 发生ABO-HDFN 的患儿，其母亲在妊娠期间血清IgG 抗-A(B)效价会升高，随着孕期增长，胎儿不断增大，胎儿血液进入母体血液循环增多，排除其他因素的影响，IgG 抗-A(B)效价越高，HDFN 的发生率也应随之增高，其病情也应越严重。

本研究发现母亲血清经IgG 抗-AB 吸收后，IgG 抗-A 或抗-B 效价均低于IgG 抗-AB 吸收前效价(P＜0.05)。 母亲血清经IgG 抗-AB 吸收前，IgG 抗-A 或抗-B 效价在各水平之间TBIL 结果差异无统计学意义(P＞0.05)。 进一步进行IgG 效价水平与患儿TBIL 相关性分析，发现IgG 抗-AB 吸收前IgG抗-A 或抗-B 效价水平与患儿TBIL 结果无显著相关性(r＝0.181，P＞0.05；r＝0.248，P＞0.05)。 有文献报道O 型孕妇血清IgG 效价水平与新生儿总胆红素水平无相关性，不能预测HDFN 病情的严重程度[7-8]，与本研究结果一致。

母亲血清经IgG 抗-AB 吸收后，IgG 抗-A 或-B 效价在64、128、256、512 水平之间有差异，差异有统计学意义(F＝8.401、19.622，P均＜0.05)。 进一步进行效价水平与患儿TBIL 相关性分析显示，IgG 抗-AB 吸收后IgG 抗-A 或抗-B 效价水平与患儿TBIL 结果呈正相关(r＝0.487、r＝0.629，P均＜0.05)，进一步证实与ABO-HDFN 的严重程度相关的是IgG抗-A 或抗-B 而非抗-AB。

Sonneveld 等[9]分析了导致HDFN 的抗-c、抗-E 和抗-K IgG 类的糖基化，结果发现抗-c 的IgG Fc-半乳糖基化和唾液酸化与HDFN 的严重程度相关，抗-K 的IgG Fc-岩藻糖基化水平与其导致的HDFN 严重程度有关。 已有研究表明，决定1 种是否容易通过胎盘的是Fc 端的聚糖类型，Fc 端双半乳糖化的与新生儿Fc 受体结合效率更高，使其优先通过胎盘[10]。 推测IgG 类抗-AB 与抗-A 或抗-BFc 端糖基化水平不同，使其与新生儿Fc 受体结合能力不同，导致其胎盘转运效率较低不能通过胎盘或只能少量通过胎盘，不能引起HDFN发生进而造成患儿血清总胆红素值升高。

综上所述，因ABO-HDFN 所引起的新生儿高胆红素血症通常在早期无临床症状[11-12]，通过吸收IgG 抗-AB 检测母亲血清IgG 抗-A 或抗-B 效价水平可以及时准确地预测HDFN 血清总胆红素升高趋势，给临床尽早诊断治疗提供依据。然而，由于本研究母亲血清效价为产后单次检测所得，无法排除检测时间对检测结果的影响；且没有对母体血清IgG 类Fc 区域糖基化水平进行进一步分析；加之研究时间较短和标本量稍少，可能会影响结果可靠性。 因此，有必要扩大标本量进行多中心前瞻性研究，进一步明确O 型母亲血清IgG 类与HDFN 患儿血清总胆红素的相关性。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。