牛病毒性腹泻病毒LAMP-LFD检测方法的建立及初步应用

郑如雯,黄 涛*,吴道义,禹光美,李芳芳,隋 鑫,闵婷玉

(1.贵州大学动物科学学院,贵阳 550025;2.毕节市畜牧兽医科学研究所,毕节 551700)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病(bovine viral rapid-mucosal disease,BVD-MD)的病原,属于黄病毒科瘟病毒属,主要感染牛,也可感染猪、羊等其他动物[1-2]。BVDV感染可造成牛免疫障碍并引发出血性感染,引起严重的消化道黏膜糜烂坏死、胃肠炎、腹泻等症状[3],妊娠母牛感染BVDV可导致繁殖障碍,包括产奶量下降,流产、胎儿生长缓慢及胎儿畸形等[4]。各年龄段的牛对此病毒都易感,其中幼龄牛易感性最高。更重要的是,此病毒会引起牛群中犊牛持续感染并不断向外界输出病毒,造成疾病的大范围传播,给畜牧业造成了一定的经济损失[5]。本文研究建立了一种针对BVDV的快速、简便的诊断方法,旨在为临床诊断BVDV提供参考依据。

LAMP检测技术是一种在恒温条件下利用链置换DNA聚合酶实现核酸快速扩增的方法[6]。LAMP的原理是利用BstDNA聚合酶的链置换特性,在靶基因的6个特定区域设计的4对引物,在一定的温度下能识别靶基因的6个位点并能连续对其进行替换的过程,LAMP检测方法灵敏度高、特异性好、用时短且操作简单[7-8]。目前已经有文献显示牛病毒性腹泻病毒LAMP检测方法比很多传统方法如PCR、ELISA等检测方法更快捷[9]。本试验将扩增速度快、灵敏度高的环介导等温扩增技术与能现场观察结果的横向流动试纸条相结合建立可视化的LAMP-LFD检测技术[10],该技术的原理是利用生物素标记的LAMP产物与异硫氰酸荧光素的DNA探针进行杂交,可在5 min内于LFD上完成显色和结果判断,LAMP-LFD仅需水浴锅或常规加热仪器就可快速检测目的基因,无需复杂精密的仪器,大大缩短了检测的成本和时间,该技术适用于基层和小型企业,具有良好的应用前景。

由于BVDV的5′非翻译区(5′UTR)是最保守的区域之一[11-13],因此该基因常常用于诊断BVDV感染[14]。本研究依据保守区段设计了1套LAMP引物和1条FITC标记探针,通过对各反应条件的优化建立了BVDV的LAMP-LFD检测方法,同时与常规PCR在敏感性和临床样本的检出符合率方面进行比较研究,旨在为临床BVDV感染的诊断提供一种新型的快速检测手段。

1 材料与方法

1.1 质粒及试剂

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)O型、牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV),牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus 1,BoHV-1)、52份BVDV牛血清均由贵州大学动物疫病研究室保存;Bst DNA2.0聚合酶购自NEB公司;横向流动试纸条购自Millenia Biotec GmbH公司;dNTP Mix、RNA提取试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。牛病毒性腹泻病毒阳性标准质粒pUC57-5′UTR(287 bp)由贵州省动物疫病研究室前期构建并保存。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI中GenBank公布的BVDV的5′UTR基因(GenBank登录号:AY278 559.1),利用Meg Align分析其保守区序列,应用Primer Explore V5在线软件设计4条用于LAMP扩增的特异性引物,分别如下:外引物BVDV-F3/BVDV-B3、内引物BVDV-FIP/BVDV-BIP,在上游内引物BVDV-FIP的5′端用BIO标记;同时设计合成1条经FITC标记的特异性探针BVDV-HP,用于LFD的杂交试验(表1)。以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 LAMP反应体系的优化

利用质粒小提试剂盒提取pUC57-5′UTR阳性质粒作为DNA模板,建立LAMP反应体系,总体积为25 μL:1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U·μL-1), 2.5 μL 10×等温扩增缓冲液, 3 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1), 2 μL MgSO4(100 mmol·L-1), BVDV-F3/BVDV-B3各2.5 μL, BVDV-FIP/BVDV-BIP各0.5 μL, 1 μL DNA模板,以及9.5 μL ddH2O。LAMP反应结束后,立即取出反应管置于冰盒中终止反应。取10 μL反应液与190 μL ddH2O混合均匀。将横向流动试纸条的样本端插入混合液中进行反应并于5 min之内读取试验结果。

1.3.1 温度优化 将上述反应体系分别在温度为61、62、63、64、65、66 ℃的条件扩增反应1 h后,经80 ℃终止反应5 min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳反应温度。

1.3.2 时间优化 保持其他条件不变,对反应体系的时间进行优化。反应初始时间为10 min,间隔10 min为一个刻度进行优化(10、20、30、40、50、60 min),反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳反应时间。

1.3.3 聚合酶浓度优化 保持其他条件不变,对聚合酶浓度进行优化,设置Bst DNA 2.0聚合酶浓度分别为80、160、240、320、400、480 U·mL-1进行扩增,取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳聚合酶浓度。

1.3.4 内外引物浓度比优化 保持其他条件不变,对内外引物浓度比进行优化,设置内外引物浓度比分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1进行扩增,取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳内外引物浓度比。

1.3.5 dNTP Mix浓度优化 保持其他条件不变,对dNTP Mix浓度进行优化,设置dNTP Mix浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1进行扩增,取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳dNTP Mix浓度。

1.3.6 Mg2+浓度优化 保持其他条件不变,对Mg2+浓度进行优化,设置Mg2+浓度分别为2、4、6、8、10 mmol·L-1进行扩增,取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳Mg2+浓度。

1.4 LAMP扩增产物的LFD检测

对LAMP反应体系进行优化后,使用BIO标记的探针进行LAMP反应,反应结束时不经过终止反应,在反应体系中加入浓度为20 pmoL探针RA-HP 2 μL,63 ℃杂交5 min。杂交结束后,从反应液中取8 μL杂交液加入到100 μL缓冲液中混匀,将试纸条浸入其中,静置3 min观察质控线与检测线的颜色变化。

1.5 LAMP-LFD特异性试验

根据RNA提取试剂盒提取FMDV、BEFV、BoHV-1的RNA利用反转录试剂盒反转录为cDNA,利用上述优化后的LAMP反应条件,设立阴性对照,分别以pUC57-5′UTR的DNA及上述cDNA为模板进行LAMP扩增,再取反应产物经琼脂糖凝胶电泳及LFD分别进行检测,分析本研究建立的LAMP-LFD检测方法的特异性。

1.6 LAMP-LFD敏感性试验

将提取的pUC57-5′UTR质粒DNA并测量其浓度,根据拷贝数计算公式:(6.02×1023拷贝·mol-1)×质粒浓度(ng·μL-1)×10-9/(质粒碱基数×660)=拷贝数(copies)·μL-1,计算所提取的质粒pUC57-5′UTR拷贝数并将其稀释至107～100拷贝·μL-1,以浓度分别为1.9×107～1.9×100拷贝·μL-1的质粒为模板,以无菌ddH2O为阴性对照,用上述优化后的反应条件进行LAMP扩增,反应结束后取反应产物经LFD进行检测,同时将相同模板利用BVDV-F3/BVDV-B3特异性引物进行PCR扩增,PCR反应条件:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环;72 ℃ 10 min, 终止反应后取反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。分析本研究建立的LAMP-LFD检测方法和PCR检测方法的敏感性。

1.7 BVDV的临床应用及检测

将采集的52份临床疑似BVDV感染样品提取RNA,再反转录为cDNA分别进行LAMP-LFD和PCR检测(PCR扩增所用引物为BVDV-F3/BVDV-B3,预扩增片段为225 bp),分析两种检测方法的检测结果。

2 结 果

2.1 LAMP的反应温度的优化

为优化LAMP反应温度,设置6组反应温度(61～66 ℃)进行优化。结果如图1所示,反应温度为64 ℃时,条带最为清晰明亮,所以选用64 ℃作为最佳反应温度。

2.2 LAMP的反应时间的优化

为优化LAMP反应时间,设置6组反应时间进行优化。结果如图2所示,反应时间为40 min时,条带最为清晰明亮,所以选用40 min作为最佳反应时间。

2.3 LAMP的Bst DNA 2.0聚合酶浓度的优化

为优化LAMP的Bst DNA 2.0聚合酶浓度,设置6组聚合酶浓度进行优化。结果如图3所示,Bst DNA 2.0聚合酶浓度为320 U·μL-1时,条带最为清晰明亮,所以选用320 U·μL-1作为反应的最佳Bst DNA 2.0聚合酶浓度。

M. DL 2000 DNA相对分子质量标准; NC. 阴性对照; 1～6. 80、160、240、320、400、480 U·μL-1 Bst DNA 2.0聚合酶 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-6. 80, 160, 240, 320, 400, 480 U·μL-1 Bst DNA 2.0 polymerase图3 LAMP Bst DNA 2.0聚合酶浓度优化结果Fig.3 Optimization results of Bst DNA 2.0 polymerase concentration

2.4 LAMP的内外引物浓度比的优化

为优化LAMP的内外引物浓度比,设置6组内外引物浓度比进行优化。结果如图4所示,内外引物浓度比浓度为4∶1时,条带最为清晰,所以选用4∶1作为反应的最佳内外引物浓度比。

M. DL 2000 DNA相对分子质量标准; NC. 阴性对照; 1～5. 浓度比分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-5. Concentration ratio were 1∶1, 2∶1, 4∶1, 8∶1, 16∶1, respectively图4 LAMP 内外引物浓度比优化结果Fig.4 Optimization results of lamp concentration ratio between internal and external primers

2.5 LAMP的dNTP Mix浓度的优化

为优化LAMP的dNTP Mix浓度,设置6组dNTP Mix浓度进行优化。结果如图5所示,dNTP Mix浓度为1.0 mmol·L-1,条带最为清晰,所以选用1.0 mmol·L-1作为反应的最佳dNTP Mix浓度。

M. DL 2000 DNA相对分子质量标准; NC. 阴性对照; 1～6. 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-6. 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 mmol·L-1图5 LAMP dNTP Mix浓度优化结果Fig.5 Optimization results of dNTP Mix concentration

2.6 LAMP的Mg2+浓度的优化

为优化LAMP的Mg2+浓度,设置5组Mg2+浓度进行优化。结果如图6所示,Mg2+浓度为4 mmol·L-1,条带最为清晰,所以选用4.0 mmol·L-1作为反应的最佳Mg2+浓度。

M. DL 2000 DNA相对分子质量标准; NC. 阴性对照; 1～5. 2、 4、 6、 8、 10 mmol·L-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-5. 2,4,6,8,10 mmol·L-1图6 LAMP Mg2+浓度优化结果Fig.6 Optimization results of Mg2+ concentration

根据上述条件进行优化后,LAMP最佳反应体系:1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(320 U·μL-1),2.5 μL 10×等温扩增缓冲液,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1),1 μL MgSO4(4 mmol·L-1),BVDV-F3/BVDV-B3各2 μL,BVDV-FIP/BVDV-BIP各1 μL,1 μL DNA模板,11 μL ddH2O;64 ℃反应40 min。

2.7 LAMP-LFD特异性试验

分别以pUC57-5′UTR的DNA及BVDV、FMDV、BEFV、BoHV-1的cDNA为模板进行LAMP扩增。结果显示,以pUC57-5′UTR为模板的LAMP扩增产物经电泳及LFD检测的结果为阳性,其他模板及阴性对照均呈阴性(图7),结果表明该方法特异性强。

M. DL 2000 DNA相对分子质量标准; NC. 阴性对照; 1. BVDV; 2. FMDV; 3. BEFV; 4. BoHV-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1. BVDV; 2. FMDV; 3. BEFV; 4. BoHV-1图7 LAMP-AGE(A)和LAMP-LFD(B)的特异性检测结果Fig.7 Specific detection results of LAMP-AGE(A) and LAMP-LFD(B)

2.8 LAMP-LFD敏感性试验

对提取的pUC57-5′UTR质粒进行10倍倍比稀释,以浓度1.9×107～1.9×100拷贝·μL-1的质粒为模板,以无菌ddH2O为阴性对照,并在优化条件上进行LAMP扩增及普通PCR扩增。结果表明,PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳的检测最低模板浓度为1.9 ×103拷贝·μL-1; LAMP扩增后,LFD的检测最低模板浓度为1.9×101拷贝·μL-1(图8)。结果表明,LAMP-LFD的敏感性较高。

2.9 临床病料检测

利用本研究建立的LAMP-LFD方法和PCR方法对临床52份疑似感染牛病毒性腹泻病毒的病料进行检测,结果显示(图9),两种检测方法的阳性样本数均为5份,检测符合率为100%(表2),表明本研究所建立的LAMP-LFD方法可应用于临床实践。

表2 BVDV LAMP-LFD检测方法的临床应用Table 2 Clinical application of BVDV LAMP-LFD

3 讨 论

随着社会经济的快速增长和人们生活质量的提高,对畜禽产品的需求增加,促进了畜牧养殖业的发展。为了提高养殖场的经济效益,不仅需要引进先进的养殖技术,还需要做好动物疾病的防控工作[15]。BVDV是常见一种传染性较强的病毒性疾病。近年来,BVDV在我国西北、西南、华北、东北等地区流行,呈广泛流行趋势[16]。BVDV不仅可在不同年龄阶段的牛群中快速传播,还会感染猪、羊等其他动物,造成的一定的经济损失,故建立一种快速、简单、可靠的检测方法对控制BVDV传播非常重要。

目前针对BVDV的检测方法有PCR、qPCR、ELISA、竞争性阻断酶联免疫测定法以及RT-LAMP等[17-20],最常用于BVDV检测的分子生物学方法为PCR扩增,但这些检测方法需要配备价格昂贵的专业检测设备,基层推广存在很大难度。LAMP应用广泛,耗时短、敏感度高,但单一的LAMP技术需要采用钙黄绿素测定、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸镁的浊度测量及荧光染料检测等步骤来判定,这些检测技术的操作条件要求比较高,在基层会受限于设备条件或耗时过长等原因而不能广泛应用。另外,钙黄绿素需要低温保存,运输成本较高,目视荧光检测判定方法中使用的一些染料如SYBR Green可与扩增产物核酸结合,影响扩增产物量[21],以上方法均不能区分特异与非特异性扩增。与单一的LAMP方法相比,LAMP-LFD检测不需要钙黄绿素,解决了钙黄绿素的运输问题,不需要琼脂糖凝胶电泳,同时也不需要如PCR仪、荧光显微镜等特殊仪器,柴书军等[22]建立的应用于猪细小病毒7型检测的LAMP-LFD法,检测时间只需60 min;杨倩等[23]建立的应用于羊口疮病毒检测的LAMP-LFD法,检测时间只需40 min。孙盼盼等[24]建立的猪支原体肺炎LAMP-LFD快速检测方法,从基因组DNA提取到LFD结果判断只需40 min左右。LAMP-LFD检测方法所需时间比常规PCR短,只需恒温水浴即可完成。同时,LFD检测方法对LAMP结果的判定是基于序列间特异性杂交,利用FITC标记探针与BIO标记LAMP产物特异性结合,可以在较短时间内得到直观正确的结果。

本研究通过将LAMP与LFD结合,建立了一种快速有效的LAMP-LFD检测BVDV的方法,用此方法对BVDV及其他样品进行检测,结果发现除pUC57-5′UTR质粒DNA为阳性外,其余均为阴性,表明该方法特异性较强;同时,LAMP-LFD检测BVDV的灵敏度为1.9×101拷贝·μL-1,比传统PCR方法灵敏度高;此外,本研究还优化了温度、反应时间Mg2+浓度、dNTP 浓度等反应体系及反应条件,优化后的LAMP能在40 min内有效地完成扩增;应用LAMP-LFD对52例疑似BVDV感染的样本进行测试,确定5例为BVDV阳性,与PCR检测结果符合率为100%,表明LAMP-LFD可应用于BVDV的临床检测。

4 结 论

本研究成功建立了用于BVDV快速检测的LAMP-LFD方法,特异性强,检测时间短,操作简单,灵敏性高,可作为一种新型检测方法应用于现场及基层检测,对于开发BVDV感染的新型诊断技术具有良好发展前景。