猪传染性胃肠炎病毒感染仔猪免疫器官的组织病理学观察

贺叶青,左百姣,李庆豪,孙 娟,金 鑫,夏 璐*,魏战勇

(1.河南农业大学动物医学院,郑州 450046;2.动物病原与生物安全教育部重点实验室,郑州 450046)

猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridaefamily)、α冠状病毒属(Alphacoronaviruses)成员,是引起仔猪腹泻的重要病原[1]。1946年Doyle等首次发现该病毒是引起猪传染性胃肠炎的病原,随后该疾病在许多国家暴发[2]。我国于1956年发现该病,并在多个省份相继报道[3]。TGEV感染通常发生在寒冷季节,如冬季和早春,主要引起2周龄以内仔猪发生呕吐、腹泻和脱水,对仔猪的致死率高达100%,给养猪业造成巨大的经济损失。目前疫苗接种是防控TGEV感染的主要措施,但是近年来随着TGEV变异株的出现,使该病无法得到有效控制[4]。

研究表明,TGEV感染仔猪主要引起消化系统症状,导致空肠和回肠绒毛萎缩甚至脱落,肠壁渗透压失衡而腹泻脱水。最新研究发现变异的TGEV还可以感染呼吸道,在仔猪肺泡巨噬细胞中复制,造成肺的广泛损伤[5]。

目前关于TGEV组织嗜性的研究大多集中在感染仔猪的肠道。研究发现被感染仔猪回肠派伊尔氏结区域明显缩小,sIgA阳性细胞、CD3+T细胞和树突状细胞数量显著降低,并且在淋巴细胞、巨噬细胞中检测到有病毒颗粒分布,提示TGEV还可感染仔猪的免疫系统[6]。因此,本文对TGEV感染后仔猪的免疫系统进行全面、深入研究,不仅为TGEV的免疫致病机制提供理论依据,同时也对该病的诊断、防治提供指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 从河南某猪场购买10只健康状况良好的5日龄仔猪,试验前经反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测仔猪粪便中TGEV、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等常见猪腹泻传染病原核酸阴性,采集仔猪血清酶联免疫吸附试验检测仔猪血清中TGEV抗体阴性。

1.1.2 病毒、抗体及主要试剂 TGEV HN-2012毒株由河南省动物源性食品安全重点实验室制备和保存;TGEV N蛋白单克隆抗体由江苏省农业科学院李彬研究员馈赠;(鼠/兔)SP试剂盒(货号KIT-9720)、AEC显色试剂盒(货号AEC-0037),购自福州迈新生物技术开发有限公司;柠檬酸钠抗原修复液(货号C1010),购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和感染试验 10头5日龄健康仔猪随机分为空白对照组和TGEV感染组,每组5头,分别饲养在两个不同的封闭猪舍内,每隔6 h人工喂奶。感染组仔猪口服10 mL TGEV(TCID50为107·0.1 mL-1),空白对照组仔猪口服相同体积的DMEM培养基,仔猪在感染5 d后逐一进行安乐死剖杀。所有动物试验程序均按照河南农业大学动物伦理与使用委员会的指导方针进行。

1.2.2 样品采集与处理 仔猪处死后,分别采集仔猪的中枢免疫器官(胸腺)和外周免疫器官(脾、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、髂下淋巴结、颈浅淋巴结、下颌淋巴结),一式三份,固定在40 g·L-1多聚甲醛中以备后续使用。

1.2.3 组织切片的制备 仔猪的各脏器固定48 h后,从多聚甲醛中取出修块,放入包埋盒中流水冲洗过夜,然后依次按照梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋、石蜡切片机切片的过程处理,最后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色。

1.2.4 HE染色 为了解TGEV感染仔猪后免疫器官的病理变化,对免疫系统的各组织样品进行HE染色。制作好的石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水后,用HE染色,中性树胶封片后进行观察和分析。

1.2.5 免疫组化染色 为了分析TGEV在仔猪免疫系统中的分布,用TGEV N蛋白单克隆抗体进行染色。采集的各组织经脱蜡、水化和流水冲洗后,用0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲溶液(pH=6.0)对组织进行抗原修复,过氧化氢溶液室温孵育10 min阻断内源性过氧化物酶的干扰,50 g·L-1牛血清白蛋白溶液室温封闭10 min阻断抗体的非特异性结合。接着,将TGEV N蛋白单克隆抗体(1∶500)在4 ℃条件下孵育过夜,生物素标记的羊抗小鼠IgG聚合物与样本室温孵育10 min,链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶室温孵育10 min,最后用AEC显色试剂盒对样品进行显色。

2 结 果

2.1 组织病理学分析

2.1.1 中枢免疫器官的病理变化 胸腺组织的HE染色结果显示,空白对照组仔猪胸腺的结构未见异常,皮质和髓质边界清晰,胸腺小体清晰可见(图1A);TGEV感染组仔猪胸腺髓质区域增大,淋巴细胞减少(图1B)。

2.1.2 外周免疫器官的病理变化 脾组织的HE染色结果显示,空白对照组仔猪脾的结构未见异常,红髓、白髓和边缘区结构清晰,淋巴细胞染色正常(图2A);TGEV感染组仔猪脾被膜和小梁增厚,红髓增多,脾索和脾窦界限不清晰,淋巴细胞减少,红髓中有大量红细胞浸润(图2B)。

扁桃体组织的HE染色结果显示,空白对照组仔猪扁桃体的结构未见异常,扁桃体被膜、结缔组织和淋巴滤泡染色清晰(图2C);TGEV感染组仔猪扁桃体细胞淡染,淋巴滤泡和淋巴细胞均减少(图2D)。

淋巴结组织的HE染色结果显示,空白对照组仔猪淋巴结结构未见异常,淋巴小结结构清晰完整(图2E、2G、2I、2K和2M);TGEV感染组仔猪的淋巴结均有不同程度的损伤,显微镜观察均可见淋巴结肿大,淋巴窦中有大量血细胞浸润并伴有铁锈色颗粒,提示巨噬细胞吞噬作用增强。颈浅淋巴结髓质中髓索和髓窦界限不清,髓窦中充满淡红色红染物质(图2F);腹股沟淋巴结可见淋巴细胞增生,呈团岛状分布,淋巴窦扩张,髓质的髓索变粗(图2H);下颌淋巴结可见淋巴小结边界模糊(图2J);肠系膜淋巴结可见细胞淡染,淋巴细胞减少(图2L);髂下淋巴结淋巴细胞增多,小梁增厚(图2N)。

2.2 TGEV在仔猪免疫系统的分布

2.2.1 中枢免疫器官TGEV的分布 胸腺的IHC染色结果显示,空白对照组仔猪胸腺未见明显阳性着色(图3A);TGEV感染组仔猪胸腺的被膜和皮质中看到少量特异性红色着色点(图3B)。

2.2.2 外周免疫器官TGEV的分布 脾组织的IHC染色结果显示,空白对照组仔猪脾未见明显阳性着色(图4A);TGEV感染组仔猪脾红髓和边缘区可见大量淋巴细胞呈特异性红色着色点(图4B)。

扁桃体组织的IHC结果显示,空白对照组仔猪扁桃体未见明显阳性着色(图4C);TGEV感染组仔猪扁桃体被膜下方的弥散淋巴组织呈特异性红色着色点(图4D)。

淋巴结组织的IHC结果显示,空白对照组仔猪淋巴结未见明显阳性着色(图4E、4G、4I、4K和4M);TGEV感染组仔猪颈浅淋巴结和腹股沟淋巴结被膜下浅层皮质区有大量淋巴细胞呈特异性红色着色点,大多分布在铁锈色沉积周围(图4F和4H),下颌淋巴结可见淋巴小结周围有特异性红色着色点(图4J),肠系膜淋巴结和髂下淋巴结浅层皮质区有少量特异性红色着色点,与对照组对比不明显(图4L和4N)。

TGEV存在于多种免疫器官,病毒载量以脾为最高,其他器官病毒载量由高到低依次为颈浅淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结、髂下淋巴结、胸腺(图5)。

3 讨 论

TGEV是一种肠致病性冠状病毒,主要引起仔猪呕吐、腹泻、脱水等临床症状,剖检可见感染仔猪的胃中充满着未消化的凝乳块,肠壁明显变薄,肠腔内充满大量黄色液体内容物,同时伴有肠系淋巴结出血[7-9]。镜检发现TGEV感染主要引起仔猪肠绒毛萎缩,上皮细胞空泡化并出现脱落,最终导致仔猪的营养吸收障碍和腹泻[7]。深入研究发现,TGEV主要感染仔猪的肠上皮细胞,包括肠细胞、干细胞和杯状细胞[6]。目前,TGEV感染仔猪的相关研究大多集中于肠道,而TGEV对仔猪全身免疫系统影响的研究报道较少[10-11]。免疫系统是机体执行免疫功能的机构,在抵御病原微生物入侵机体中发挥重要作用。因此,开展TGEV对仔猪免疫系统的研究有助于全面了解该病毒的致病性,对临床指导TGEV的防控具有重要的理论和实践意义。本试验通过HE染色对TGEV感染仔猪后免疫器官的病理变化进行分析,并且通过IHC染色检测了病毒粒子在免疫器官内的分布。

HE结果表明,TGEV感染仔猪可引起中枢免疫器官免疫细胞减少;外周免疫器官肿大、出血,免疫细胞减少。相关研究发现TGEV感染后病猪脾肿大、充血,部分淋巴结肿胀、充血,颜色变深呈紫红色[8]。引起仔猪腹泻的猪肠道冠状病毒还包括PEDV、PDCoV等。PEDV感染仔猪后也发现仔猪的免疫系统受到损伤,如免疫细胞减少,肠系膜淋巴结毛细血管充血或轻微出血,脾内有大量嗜酸性粒细胞浸润[12]。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引发的新冠肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)严重威胁人类健康。调查发现COVID-19患者免疫功能受损在临床中表现非常突出,主要表现为脾体积明显缩小,红髓脾窦扩张、充血,白髓呈不同程度萎缩,嗜血细胞增多,中性粒细胞、浆细胞数量增多,嗜酸性粒细胞数量下降[13]。进一步研究发现,COVID-19患者外周血T淋巴细胞(CD4+和CD8+)过度激活,表现为CCR4+CCR6+Th17细胞的增加和CD8+T淋巴细胞的高细胞毒性,提示患者遭受了严重的免疫系统损伤[14]。上述结果表明冠状病毒可以对机体的免疫系统造成损伤,今后应重视冠状病毒对免疫系统的影响。

IHC的结果显示,TGEV存在于多种免疫器官,并且脾中的病毒载量最高(图8P)。间接免疫荧光方法也在仔猪肠系膜淋巴结中检测到了TGEV[15]。RT-PCR方法也在仔猪的脾、扁桃体、腹股沟淋巴结等免疫器官内检测到了PDCoV和猪急性腹泻综合征冠状病毒的存在[16-17]。IHC和原位杂交等方法也在COVID-19患者脾淋巴细胞和巨噬细胞内检测到SARS-CoV-2[13]。这些研究说明了冠状病毒可以感染免疫系统。猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N, pAPN)是TGEV感染的主要功能性受体[18]。TGEV分布于多个免疫器官,作者猜测这些免疫器官中存在pAPN的表达。作者还发现感染仔猪脾的红髓中有大量血细胞浸润,淋巴组织中有大量血细胞浸润和铁黄素沉积,推测TGEV感染仔猪后引起病毒血症,通过血液循环,到达脾、淋巴结等免疫器官,促使机体启动一系列免疫应答,造成免疫器官损伤。

综上,TGEV感染仔猪后,引起各免疫器官不同程度的损伤,且在各免疫器官内均有TGEV分布,表明TGEV能够感染仔猪免疫系统并引起仔猪各免疫器官组织损伤,降低机体的免疫功能。今后的研究中应关注猪肠道冠状病毒对仔猪免疫系统的影响,在临床治疗中采取相应的干预措施。

4 结 论

TGEV感染损伤仔猪免疫器官,降低机体免疫功能。