诱导多能干细胞体外分化血小板技术的研究进展*

岳伟 顾海慧(中国人民解放军海军军医大学第一附属医院 输血科，上海 200433)

血小板是哺乳动物体内的无核小血细胞，主要参与调节凝血以防止出血，同时也在诸如免疫炎症反应在内的多种生理过程中发挥作用[1]。 血小板输注是治疗由于创伤、手术、放化疗或遗传性血小板疾病导致血小板缺乏和/或功能障碍的最有效方法。 迄今为止，输血用血小板完全依赖献血者，难以满足日益增长的血小板输注需求[2]。 未来随着人口老龄化，社会对血液制剂需求的不断扩大，供需矛盾将进一步激化[3]。 此外，血小板制备中可能存在细菌污染，制备后需要在(22±2)℃的条件下震荡保存，根据保存袋的差异，保存期24 h 至5 d 不等。 严格的保存条件、较短的保存期、以及输注后可能存在的同种免疫反应、血小板输注无效(platelets transfusion refractoriness，PTR)等，亦是限制血小板临床应用的原因之一[4]。 因此，亟需扩大血小板来源以满足不断增加的临床需求，体外产生的血小板成为研究方向之一。

成人血小板主要由骨髓(bone marrow，BM)中的巨核细胞(megakaryocytes，MKs)释放。 MKs 在成熟期间迅速增长，直径可达到100 μm 以上，细胞质伸出长的丝状衍生形成前血小板(proplatelet)，其尖端延伸突破骨髓窦血管进入血流中，被血流剪切成血小板[5]。 随着对MKs 认识的不断深入，研究者发现MKs 也能从骨髓迁移至肺部等远隔器官，参与血小板的生成。 例如小鼠模型中肺部负责生产超过一半的血小板[6]。 经典的巨核造血模型认为，造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)处于发育层次结构的顶端，HSCs 可依次分化为多能祖细胞(multipotent progenitor cell，MPP)、普通髓系祖细胞(common myeloid lineage progenitors， CMP)、巨核/红细胞祖细胞(megakaryocyte-erythrocyte progenitors，MEP)，及巨核祖细胞(megakaryocyte progenitor， MKP)。 最近研究发现，一类造血干细胞亚群可绕过MPP 阶段，直接进入MKP 阶段并形成巨核细胞，纯化和扩大这一亚群可实现更好的体外血小板生成，缩短分化时间并提高血小板纯度[7]。

虽然体外生产血小板是可行的，但在体外MKs 输出效率远不如体内高。 1 个MK 在体内可产生1 000 余个血小板，但在体外即使通过剪切力系统增强血小板释放，也只可产生约70 ～80 个血小板[8]。 为了提高体外血小板产生效率，首先必须生产和扩增MKs。 我们对最新诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells， iPSCs)体外分化生产血小板技术方法作一综述，代表性技术方法见表1。

表1 诱导多能干细胞体外分化巨核细胞和血小板的技术方法

1 诱导多能干细胞

iPSCs 具有多向分化和自我更新的能力，能在体外无限增殖。 与胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESCs)相比，iPSCs 来源于体细胞，通过重编程来重获干性，来源不受限，无伦理争议。 Gaur 等[9]第1 个报道了在体外从人类胚胎干细胞中产生血小板的方案，但平均每个ESCs 能产生的MKs 不足1 个，并且ESCs 的提取需要破坏囊胚，分化过程较久，伦理争议多，移植后ESC 来源细胞的异基因免疫反应亦成为限制因素。 而HSCs 来源受限，体外大量扩增并维持干性在技术层面尚未攻克，不适合成为体外生产血小板的来源。 综上，iPSC 是最合适的体外血小板生成的来源细胞[10]。

从再生医学角度来说，患者自身和高度免疫相容的iPSCs 可以作为源细胞，它可以产生在超微结构、表面抗原表达和功能等方面类似于人体内的血小板[8，11]。 此外，由于源头细胞没有感染风险和独立于献血者的供应，无菌制造的iPSCs 来源的血液制剂无致病性。 而且，iPSCs 作为源细胞具有预防PTR 的重要优势。 它可以通过建立β2-微球蛋白(β2M)缺失的无HLA-1 类表达的功能性iPSC 衍生血小板，或者使用CRISPR/Cas9 系统敲除HLA-1 类抗原基因，从而避免受体输血产生反应性抗体，进而可以预防患者因反复输血而导致的PTR[12-13]。 综上所述iPSCs 技术为干细胞生物学和细胞治疗开辟了一个新的窗口，也为疾病建模、药物筛选、细胞可用性和免疫排斥研究提供了独特的模型[14]。 最新的研究发现，通过基因编辑自体iPSC 来源的HSC 移植可以用于治疗遗传性血液病[15]。 iPSC 衍生血小板的制备也取得了重要进展，有望用于临床。

2 转分化技术

近些年体细胞转分化技术得到了快速发展，通过控制特定转录因子的表达可将体细胞直接转分化为MKs，从而有望提高体外血小板生成效率。 2015 年，Siripin 等[16]通过过表达ETS 特异性转录因子FLI1 和ERG基因将人骨髓红细胞转化为MKs，并在体外产生功能性血小板。 先前在小鼠和人类的研究表明，FLI1 是MKs 分化和血小板生成所必需的，而ERG基因在HSC 稳态维持中起重要作用，两因子的相互作用在正常造血过程中对控制MKs 的数量和功能至关重要。2016 年，Pulecio 等[17]证实过表达GATA2、RUNX1、GATA1、TAL-1、LMO2 和C-MYC 等6 个转录因子可以有效地将小鼠和人类成纤维细胞转化为巨核细胞祖细胞(MKPs)。 该细胞CD41 表达阳性、细胞核分为多叶、染色体倍性高于4N，是具有临床应用潜力的功能性MKPs。 2022 年，裴雪涛等[18]通过联合使用Bix01294、RG108、VPA、PD0325901 等4 个小分子成功地将人脐带血红细胞诱导为MKs (iMKs)，iMKs 类似于天然的MKs，可以释放功能性血小板。 以上研究虽然已经证实多种细胞可以直接重编程为MKs，但并没有对血小板的产生效率做进一步优化，所以暂时仍无法实现MKs 和血小板的大规模生产。

3 基因编辑

从iPSCs 到血小板可分为3 个步骤，包括从iPSCs 分化为HSCs，HSCs 分化为MKs 以及MKs 产生血小板[2]。 其中第1 步可由2 种途径完成，1 种是在二维条件下与饲养细胞(如C3h10t1/2 或OP-9 基质细胞)共培养；1 种是在无饲养细胞的3D 培养系统中诱导形成拟胚体(embryoid bodies，EBs)[19]。 2010 年，Takayama 等[20]首次报道了利用人表皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts， HDFs)来源的hiPSCs 利用饲养层细胞共培养体系诱导分化功能性血小板的成功案例。 该方案中瞬时激活C-MYC 表达对hiPSCs 高效生成血小板至关重要。 在此基础上，Nishimura 等[21]首先将犬胚胎成纤维细胞来的犬诱导多能干细胞(ciPSCs)成功分化为MKs和血小板。 这是首次从大动物模型中获得功能性血小板的研究。 以上方法都依赖于含血清培养液和饲养层细胞，难以避免相关免疫反应。 2014 年，Feng 等[11]提出了1 种在无血清、异种物质和饲养细胞条件下，使用造血内皮中间体而非EB 从hiPSCs 中大规模生产功能性血小板的方法。 该研究通过小分子IBET151 抑制C-MYC 表达，提高MKs 向血小板分化的效率。 所产生的血小板同样在形态和功能上与外周血小板相似。 Nakamura 等[22]通过将C-MYC、原癌基因B 细胞特异性鼠白血病毒插入位点-1 (B cell specific maloney murine leukemia virus integration site-1，BMI-1)和原癌基因BCLXL依次导入hiPSC 来源的HPCs 后继续分化培养，可建立永生化巨核细胞祖细胞系(immortalize MK progenitor cell line，imMKCL)。 该方案可以大量冷冻储存imMKCLs 作为主细胞库，然后按需解冻、扩张并分化血小板。 由于增殖能力的原因，在25～50 L 培养基条件下，理论上5 d 内imMKCL 大约产生1011个血小板，相当于1 次输血量，但每个MKs 仅产生10 个血小板，而且功能不如天然血小板。 2016 年，Moreau等[23]通过在iPSCs 向MKs 分化过程中过表达GATA1、FLI1和TAL1，建立了1 种可冷冻、可扩增的巨核细胞系-正向程序化巨核细胞(fopMKs)，fopMKs 可在高浓度TPO(100 ng·mL－1)和IL-1β 刺激下持续扩增60 d；如果将培养条件改为低浓度TPO(20 ng·mL－1)和SCF，fopMKs 可稳定增殖至少90 d。 另外，fopMKs 可以在解冻复苏后继续增殖数月，纯度超过90%。 虽然这种方法可大规模生产血小板，但此类血小板成熟度同样不如天然血小板，并且在小鼠体内的半衰期较短。 2020 年，Cullman 等[24]发现GATA1 和PBX1 过表达可提高2～2.5 倍的MKs 产生，且这类MKs 可长期培养。 但过表达GATA1 和PBX1 并不能促进MKs 的成熟或血小板的释放，需要进一步利用小分子化合物或者生物反应器等方法进行优化。 值得一提的是，Lyn 是酪氨酸激酶(SFKS)Src 家族的一员，抑制Lyn 的表达可导致轻度增加MKs 和血小板的生成。 2021 年，Moroi 等[25]利用CRISPR/Cas9 技术在iPSCs 中构建条件性Lyn 缺陷的MKs。 通过分析Lyn 缺陷巨核细胞在一系列血小板激动剂作用下的分化和活化效率， Lyn 缺陷促进了HPCs 向成熟MKs 的体外分化，并显示出更好的止血效果，并能够在体外产生更多的血小板样颗粒(PLP)。 此外，朱芳芳等[26]使用基因表达共享(gene expression commons， GEXC)平台确定了HSC 向MkPs (mks 和血小板的直接前体细胞)分化的调节因子并绘制了调控网络，证实通过慢病毒转染技术过表达MZF1、GSX2、HOXC6、HES7、FOXB1、MXD3、HOXA9、NFATC1 和PCGF2 等9 个候选转录因子可促进HSC 生成MkP，使其生成量增加4 至5 倍，识别这些调控因子将有助于通过操控这些基因或通路满足血小板的临床需求。

迄今为止，现有的研究已经明确了数个在发育过程中控制巨核细胞和血小板的命运的关键转录因子，并通过调控他们的表达不断优化体外血小板诱导策略。 转录因子通过激活或抑制细胞因子或化学化合物的外部信号，以及通过与基质细胞共培养或在3D 条件下提供1 个类似于胚胎发育的环境[27]。 因此，研究转录因子与基因编辑均对促进体外血小板的生成具有重要作用。

4 小分子化合物

小分子化合物可以通过替代TPO 作用，促进巨核细胞成熟以及阻止GPIbα 脱落等作用促进血小板产生。

虽然TPO 及其受体c-MPL 是iPSCs 向MKs 分化过程中不可缺少的细胞因子组合[28]，但其成本高昂，不适合大规模使用。 目前，多种TPO 模拟物已经获得FDA 批准可用于临床[19]。 2017 年，1 种新型的小分子化合物c-MPL 激动剂TA-316，其效果优于重组人TPO 生成素(rhTPO)，可以通过调节VEGFA 和FGF2 而促进imMKCLs 的分化，作为rhTPO 的替代物用于体外血小板生产[29]。

另外，在分化方案中小分子化合物也可以增加巨核细胞多倍体化和血小板的产生。 血小板的数量取决于2 个参数——MKs 的数量和细胞质体积，细胞质体积与倍性水平相关。 因此，多倍体化可增加每个MKs 产生的血小板数量[30]。例如Rho 激酶(Rock)抑制剂可以促进分界膜系统(DMS)、下调MYC和NFE2 的表达来驱动MKs 成熟后期的多倍体化和前血小板形成[31]。 干细胞再生素1(StemRegenin 1，SR1)可以通过抑制芳基碳氢化合物受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)调控巨核细胞谱系和多倍体化和前血小板的形成[32]。 2018 年 Jarocha 等[33]验 证 Src 激 酶 抑 制 剂(SU6656)、rho 相关激酶抑制剂(Y27632)和Aurora B 激酶抑制剂(AZD1152)同样能增加巨核细胞的倍性和体外促血小板释放。 先前研究表明[34]与脐带血来源的MKs 一样，人类iPSC 衍生的Mks 在个体发育阶段与胎儿肝脏祖细胞相对应，并且具有最小的形态发生能力，甚至低于新生儿祖细胞。2022 年研究发现[35]，巨核细胞性白血病因子1 (megakaryoblastic leukemia-1， MKL1)作为血清反应因子(SRF)转录因子的共激活因子，在多种细胞类型的分化过程中发挥作用，包括造血谱系，它通过控制参与肌动蛋白细胞骨架重塑的基因来发挥这些功能。 使用双特异性酪氨酸调节激酶1(Dyrk1)抑制剂可以促进巨核细胞的形态发生，从而增加血小板的生成，并且血小板的数量在小鼠体内得到了进一步验证，但其功能未做进一步验证。 次年闫小响等[36]进一步发现Dyrk 1B 抑制剂可以同时上调细胞周期蛋白D1 和下调p27 来促进MKs 的多倍体化。 但当前促进MK 多倍体化的研究大多建立在造血干细胞来源，建议可以尝试这种策略，从iPSCs 来源增加体外获得的MKs 的倍性，从而获得输血所需的足够数量的血小板，但来自不同倍性类型的MKs 的血小板是否具有相同的功能还有待研究。

有些小分子化合物可以通过改变阻止GPIbα 的脱落来提高血小板的产量。 比如血小板没有GPIbα 结合血管表面的vWF，血小板失去附着在血管壁上的能力会在输注后迅速被清除，而ADAM17 抑制剂可以阻止GPIbα 的脱落，但其残留物可能会对其他器官存在副作用。 2016 年1 种新型的ADAM17 特异性抑制剂KP-457 不仅可以阻止GPIbα 的脱落，而且可以与维持血小板功能产生协同作用，通过用免疫缺陷小鼠建立血小板输注后血栓形成模型，结果表明KP-457 作用的iPSC 来源的血小板在小鼠体内具有较好的止血作用[37]。

另外植物激素脱落酸(ABA)被报道能促进hiPSCs 向MKs 和血小板分化[38]。 发现脱落酸通过LANCL2 和GRP78受体依赖性方式介导CD34＋/CD45＋细胞的Akt 和ERK1/2信号通路的激活。 从而促进CD34＋/CD45＋造血干细胞的增殖和CD41＋巨核细胞的分化。 综上研究发现，这些能够控制自我更新、谱系分化和重编程的小分子化合物可以显著提高血小板的体外生成效率。

5 生物反应器

MKs 的成熟、前血小板的延伸和血小板的释放数量都依赖于微环境[39]。 大部分研究中，体外血小板所使用的静态条件仅重现了微环境的生物化学条件，而缺乏生物物理学特性，血液流动引起的剪切力可能会将血小板从前血小板上拉扯下来[25]。 因此，工业化生产血小板，物理模拟体内环境的生物反应器是关键[39]，它可以很好的监测和控制培养条件(如pH、温度、dO2、dCO2、搅拌等)，以及营养物质的均匀分布，具有更高的可扩增能力、更优的可扩展性。 基于这些优点，各研究团队开发了生物反应器。 Thon 等[40]开发了1 种微流控血小板生物反应器，通过将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和细胞外基质成分装载到芯片上来模拟骨髓环境。Blin 等[41]设计了1 个由多个血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)涂层微柱组成的生物反应器，这些微柱充当MKs 的锚，以促进MKs 有效地受到剪切力作用。 然而，由于所有反应器都是用微流控系统模拟体内微环境，这些设计假定剪切力完全来自层流，在血小板的有效生成和工业化生产方面并不是很成功。 2018 年，Ito 等[8]开发了1 种基于湍流的新的生物反应器，可以在8 升反应器中生成超过1011的血小板。 MKs 周围的局部湍流可以促进巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor， MIF)、胰岛素生长因子结合蛋白2(insulin growth factor binding protein 2，IGFBP2)和苯乙肼裂解酶(nardilysin， NRDC)这3 个新因子在MKs 中的表达，显著提高了血小板生成效率。 同一年，有研究团队使用微载体生物反应器来提高MKs 的产量，层粘连蛋白包被的微载体可以使iPSC 衍生的MKs 产量增加10 倍，且该体系获得的MKs 具有成熟MKs 的典型特征，在体内外均能产生血小板[42]。 另外，研究人员对理想剪切速率进行了量化。 Martinez 等[43]使用计算流体动力学模型(CFD)显示出细胞在生物反应器中通常经历非均匀剪切速率，他们发现调节剪切应力和流动模式对血小板的产生具有直接而重大的影响。 为了产生足够的适应临床使用的血小板，最终的目标是开发1 种具有可扩展设计的生物反应器，可以高效生产功能良好的血小板。

6 机遇与挑战

过去20 年，在体外血小板生成方面取得了振奋人心的进展，包括从iPSCs、脐带血和其他各种细胞来源大规模生产血小板，模拟MKs 生存的骨髓微环境和MKs 延伸到骨髓血窦中时受到的剪切力。 虽然也有研究寻找可以替代iPSC 作为起始细胞的来源，并且无需导入基因，例如利用脂肪组织来源的间充质干细胞/基质细胞系(ASCL)的体外巨核细胞诱导培养系统释放血小板，100 克脂肪组织可获得1011个血小板，但产量低于iPSC 来源的MKs，且ASCL 所需的扩增时间更长[44]。 目前，全球开发血小板作为新型细胞疗法的企业有美国的PlateletBio、日本的Megakaryon 等。 如上所述，日本1 家公司的相关产品已经于2021 年进入到1 期临床，血霁生物作为中国第1 家体外再生血小板公司，以血小板作为核心开发项目，血小板体外诱导再生管线目前已基本完成概念验证，正在开展体系的进一步优化。 目前血小板体外再生产业化还处于非常早期的阶段，在技术研究、扩大再生产、质控、政策监管等方面都还面临一定的挑战，国内企业也在快速发展，希望通过不断的研究和转化，我国能在再生血小板实现临床应用这一创新领域中贡献力量。 对于研究者而言，需要实现1 个能够实现高效、大规模的生产，面临的挑战包括制备血小板的质量与数量、分化的效率、细胞储存条件和生物活性等，未来还需对血小板体内、体外的生成调节及人工制备技艺与原理等方面进行更加深入的探索。 我们相信，通过多种技术的整合，未来临床血小板的输注治疗可不再依赖于献血者。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。