款冬花多糖磁性纳米粒的制备工艺研究

叶世莉,刘思美,张丽华,张婷婷,郭 可,赵 鹏*

(1.陕西中医药大学 陕西中药基础与新药研究重点实验室,陕西 咸阳 712000;2.陕西国际商贸学院,陕西 咸阳 712000)

款冬花是我国传统中药材,为植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾,具有润肺止咳、化痰平喘之功效,常用来治疗慢性支气管炎、咳嗽气喘等疾病[1]。款冬花多糖(TussilagofarfaraL.polysaccharides,TFP)具有明显的抗肿瘤、调节机体免疫、抗氧化等生物活性[2-5]。随着纳米技术的迅速发展,纳米药物逐渐应用于疾病的治疗[6-12],受到人们的广泛关注。基于此,作者以款冬花多糖为原料,将其与Fe3O4纳米粒子超声反应制备款冬花多糖磁性纳米粒,以款冬花多糖磁性纳米粒粒径和分散系数(PDI)[13]为考察指标,在单因素实验的基础上,运用Box-Behnken响应面法[14-16]优化款冬花多糖磁性纳米粒制备工艺,拟为款冬花多糖的进一步应用[17]提供一定的研究基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

款冬花,购于陕西省西安市万寿路药材市场,经陕西中医药大学王国全教授鉴定为菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾。

1,10-菲啰啉(邻二氮菲)、乙醇、抗坏血酸(VC)、醋酸钠、苯酚、六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、浓氨水等均为分析纯;去离子水(娃哈哈纯净水);KBr,光谱纯。

UV-DS5型紫外可见分光光度计;KQ-500DE型超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司;Nano-ZS ZEN3600型纳米粒度仪;FA1004型电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;T-27型傅立叶变换红外光谱仪,德国布鲁克分析仪器公司;OSB-2100型旋转蒸发器,上海爱郎仪器有限公司。

1.2 款冬花多糖的制备

参照文献[1]方法,精密称取少许干燥款冬花,用95%乙醇进行脱脂处理后,按一定料液比加入80 ℃的热水提取2次,合并滤液,经旋蒸减压浓缩;采用 Sevage法脱去蛋白、大孔树脂法脱色,经Sephadex G-100凝胶柱纯化,洗脱液透析并醇沉,冷冻干燥,即得款冬花多糖。

1.3 款冬花多糖磁性纳米粒的制备

参照文献[18-19]方法并稍作改进,采用分步法制备款冬花多糖磁性纳米粒。

按质量比2∶1精密称取FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O,溶于去离子水中,800 r·min-1搅拌使其混合均匀;将混合物加热至70 ℃,加入适量的浓氨水调节pH值至9～10,溶液迅速变为黑色;氮气保护下反应3 h,冷却至室温,用外磁体将纳米粒子分离出来,用去离子水洗涤3次后,置于45 ℃真空干燥箱中干燥24 h,即得Fe3O4纳米粒子,备用。

将一定量的Fe3O4纳米粒子置于250 mL圆底烧瓶中,加入去离子水,在一定温度、功率下超声处理使其分散均匀;称取一定量干燥的款冬花多糖溶于去离子水中,置于滴液漏斗中,滴入上述Fe3O4纳米粒子溶液中,滴加结束后,在一定功率下继续超声一定时间,用外磁体将纳米粒子分离出来,用500 mL去离子水洗涤3次后,置于60 ℃真空干燥箱中干燥,即得款冬花多糖磁性纳米粒。

1.4 款冬花多糖磁性纳米粒的制备工艺优化

采用单因素实验分别考察m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)(1∶0.5、1∶0.75、1∶1.0、1∶1.25、1∶1.5)、超声时间(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)、超声功率(250 W、300 W、350 W、400 W、450 W)对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响。

在单因素实验的基础上,选取m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)、超声时间、超声功率为考察因素,以款冬花多糖磁性纳米粒的粒径和PDI为考察指标,进行Box-Behnken响应面实验,进一步优化款冬花多糖磁性纳米粒的制备工艺。

1.5 款冬花多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定款冬花多糖含量。先绘制葡萄糖标准曲线[17,20],拟合得线性方程:y=7.4621x+0.0633,R2=0.9971。葡萄糖含量在0.01～0.1 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

精密吸取款冬花多糖溶液0.2 mL,加入蒸馏水至1.0 mL,加入1.0 mL现配的5%苯酚溶液,摇匀;加入5.0 mL浓硫酸,摇匀,静置5 min,沸水浴15 min,冷却至室温;不加款冬花多糖溶液,同法操作,作为空白对照,测定490 nm处吸光度,计算款冬花多糖含量。

1.6 铁含量的测定

采用邻二氮菲法测定款冬花多糖磁性纳米粒中的铁含量[21-22]。精密称取400.8 mg六水合硫酸亚铁铵置于250 mL容量瓶中,加去离子水溶解并定容至浓度为0.2 mg·mL-1;以抗坏血酸(100 g·L-1)为还原剂,制备一系列铁标准溶液;将一系列铁标准溶液分别加入50 mL容量中,加入100 g·L-1抗坏血酸2 mL、0.15%邻二氮菲溶液2 mL、1 mol·L-1醋酸钠溶液5 mL,定容,测定510 nm处吸光度。以Fe3+浓度(μg·mL-1)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线,拟合得线性方程:y=0.1728x+0.0568,R2=0.9910。

精密称取50 mg款冬花多糖磁性纳米粒置于烧杯中,加入适量的浓盐酸,水浴加热,待完全呈液体状后,移至100 mL容量瓶中,加去离子水定容至刻度;精密吸取1 mL上述溶液,移至50 mL容量瓶中,按上述方法测定510 nm处吸光度,计算铁含量。

1.7 理化性质分析

1.7.1 红外光谱分析

分别称取一定量的款冬花多糖、Fe3O4纳米粒子及款冬花多糖磁性纳米粒,与经过干燥脱水的KBr进行混合研磨、压片,置于红外光谱仪中进行扫描,扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.7.2 粒径分析

精密称取适量款冬花多糖磁性纳米粒样品,加入适量蒸馏水,超声分散,采用纳米粒度仪测定粒径。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)的影响

固定超声时间为40 min、超声功率为400 W,考察m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响,结果见图1。

图1 m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响Fig.1 Effect of m(TFP)∶m(Fe3O4 nanoparticles) on particle size and PDI of magnetic nanoparticles of TFP

由图1可知,随着Fe3O4纳米粒子用量的增加,款冬花多糖磁性纳米粒的粒径和PDI均逐渐减小,当m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)为1∶1.0时,粒径和PDI均最小;继续增加Fe3O4纳米粒子用量,粒径和PDI均逐渐增大。因此,m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)以1∶1.0为宜。

2.1.2 超声时间的影响

固定m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)为1∶1.0、超声功率为400 W,考察超声时间对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响,结果见图2。

由图2可知,随着超声时间的延长,款冬花多糖磁性纳米粒的粒径和PDI均逐渐减小,当超声时间为30 min时,粒径和PDI均较小;进一步延长超声时间,粒径和PDI均变化不大。因此,超声时间以30 min为宜。

图 2 超声时间对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on particle size and PDI of magnetic nanoparticles of TFP

2.1.3 超声功率的影响

固定m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)为1∶1.0、超声时间为30 min,考察超声功率对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响,结果见图3。

图3 超声功率对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on particle size and PDI of magnetic nanoparticles of TFP

由图3可知,随着超声功率的增大,款冬花多糖磁性纳米粒的粒径和PDI均逐渐减小,当超声功率为400 W时,粒径和PDI均最小;进一步增大超声功率,粒径和PDI均变化不大。因此,超声功率以400 W为宜。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果

响应面实验的因素与水平见表1,设计及结果见表2。

表1 响应面实验的因素与水平

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 回归模型的建立及方差分析

通过Design-Expert v 12软件对表2数据进行拟合,得到款冬花多糖磁性纳米粒粒径(Y1)的回归模型为:Y1=672.50+10.68A+3.06B+8.49C-5.58AB+12.98AC-48.30BC+66.22A2+39.20B2+21.20C2;款冬花多糖磁性纳米粒PDI(Y2)的回归模型为:Y2=0.5658-0.0390A+0.0136B+0.0189C+0.0262AB+0.0283AC-0.0510BC+0.0478A2+0.0356B2+0.0411C2。

回归模型的方差分析分别见表3、表4。

表4 PDI方差分析

2.2.3 响应面分析

各因素交互作用对款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI影响的响应面图分别见图4、图5。

图4 各因素交互作用对款冬花多糖磁性纳米粒粒径影响的响应面图Fig.4 Response surface plots for effects of interaction between various factors on particle size of magnetic nanoparticles of TFP

图5 各因素交互作用对款冬花多糖磁性纳米粒PDI影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for effect of interaction between various factors on PDI of magnetic nanoparticles of TFP

响应曲面的倾斜度和坡度可直观地反映两因素交互作用影响的显著性,倾斜度越低、坡度越平缓,则两因素交互作用影响越不显著;反之,则两因素交互作用影响显著。由图4、图5可知,曲线变化最大的是m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子),其次是超声功率、超声时间。

2.2.4 最佳工艺的确定

由Design-Expert v 12软件预测款冬花多糖磁性纳米粒的最佳制备工艺如下:m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)为1∶1.018、超声时间为24.587 min、超声功率为360.892 W,粒径预测值为668.423 nm,PDI预测值为0.555。综合考虑实际操作,将最佳制备工艺调整为:m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)为1∶1.0、超声时间为30 min、超声功率为400 W,在此条件下重复操作3次,得到款冬花多糖磁性纳米粒粒径为678.6 nm、PDI为0.554,测得款冬花多糖磁性纳米粒中多糖含量为16.31%、铁含量为31.31%。说明可以用该模型来分析和预测款冬花多糖磁性纳米粒的制备工艺。

2.3 理化性质分析

2.3.1 红外光谱分析(图6)

图6 款冬花多糖、Fe3O4纳米粒子、款冬花多糖磁性纳米粒的红外光谱Fig.6 FTIR spectra of TFP,Fe3O4 nanoparticles,and magnetic nanoparticles of TFP

由图6可知,款冬花多糖的红外光谱中,599.97 cm-1处为Fe3O4的特征吸收峰。款冬花多糖磁性纳米粒的红外光谱中,3 427.74 cm-1处为羟基的O-H吸收峰;1 631.60 cm-1处为游离羧酸或羧酸盐的C=O特征吸收峰;1 431.80 cm-1处为C-H吸收峰;1 125.97 cm-1处为C-O吸收峰;而577.08 cm-1处为Fe3O4的特征吸收峰。对比可知,加入款冬花多糖后,Fe3O4的特征吸收峰出现细微变化,但不影响整体吸收峰的变化。说明Fe3O4纳米粒子在款冬花多糖磁性纳米粒中以原来的结构存在,款冬花多糖只是作为载体包裹在Fe3O4纳米粒子外层,起分散作用,并不影响多糖的结构。

2.3.2 粒径分布(图7)

图7 款冬花多糖磁性纳米粒的粒径分布Fig.7 Particle size distribution of magnetic nanoparticles of TFP

由图7可知,款冬花多糖磁性纳米粒的粒径分布均匀,平均粒径为678.6 nm,PDI为0.554,表明款冬花多糖磁性纳米粒分散性好,无明显团聚现象发生。

3 结论

将款冬花多糖与Fe3O4纳米粒子超声反应制备了款冬花多糖磁性纳米粒,以款冬花多糖磁性纳米粒粒径和PDI为考察指标,采用单因素实验和Box-Behnken响应面法优化了款冬花多糖磁性纳米粒的制备工艺。确定最佳制备工艺条件如下:m(款冬花多糖)∶m(Fe3O4纳米粒子)为1∶1.0、超声时间为30 min、超声功率为400 W,在此条件下,款冬花多糖磁性纳米粒的粒径为678.6 nm、PDI为0.554,款冬花多糖磁性纳米粒中多糖含量为16.31%、铁含量为31.31%。纳米剂型有望使款冬花多糖在发挥药理活性治疗肺癌时具有靶向性,在治疗疾病的过程中能发挥最大功效,为开发款冬花多糖磁性纳米粒相关抗肿瘤药物提供了一定的依据。