胶红酵母产类胡萝卜素的研究进展

张 红,赵 鑫,吴 昊,温 彤,马 勇

(包头师范学院生物科学与技术学院,内蒙古 包头 014030)

类胡萝卜素是脂溶性萜类化合物,可分为原A和非原A化合物,也可分为“无氧胡萝卜素”和“含氧叶黄素”[1]。前者包括番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素;后者包括叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、虾红素、海胆烯酮和虾青素[2-3]。类胡萝卜素主要由8个异戊二烯基团通过共轭双键构成[4]。类胡萝卜素的颜色因共轭双键的数目不同而表现出黄、橙、红等颜色特征。人类自身不能合成类胡萝卜素,需从外界摄取,故类胡萝卜素是平衡人类膳食的重要成分。类胡萝卜素具有多种生物学功能,如维生素A活性、调节免疫力、预防癌症、降低退行性疾病(如白内障、心血管疾病等)的风险、延缓衰老等。类胡萝卜素的用途较广泛[5-9],其市场需求量增长非常迅速,预计,2022～2027年的年复合增长率(CAGR)为5.7%。 化学合成法可满足人们对类胡萝卜素的商业需求,但合成过程中产生的部分副产品具有高过敏性或致癌性。天然类胡萝卜素在植物和微生物(酵母、细菌和微藻)中发挥生物活性,但从植物中提取类胡萝卜素存在成本高、受季节限制等问题[10],而微生物发酵具有产率高、合成周期短、绿色安全、色泽纯正、易于工业化生产等优点,且不受自然条件、季节变化及病虫害的影响,在很大程度上满足了人们对天然类胡萝卜素的需求。产类胡萝卜素的微生物主要有葡萄球菌(Staphylococcus)、黄杆菌(Microbacterium)、红酵母(Rhodotorula)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、杜氏藻(Dunaliellasalina)、红球藻(Haematococcuspluvialis)等[11]。研究[12]表明,胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)具有单细胞的独特性和生长快速的优势,是工业化生产类胡萝卜素的潜在来源。在此,作者对胶红酵母产类胡萝卜素的研究进展进行综述,为类胡萝卜素的工业化生产提供理论依据。

1 胶红酵母产类胡萝卜素的代谢途径

最常见的合成类胡萝卜素的真菌有酵母和霉菌,酵母广泛分布在陆地、海洋、淡水等环境中[11],主要包括掷孢酵母属(Sporobolomycesspp.)、红法夫酵母属(Phaffiaspp.)、红冬孢酵母属(Rhodosporidiumspp.)及红酵母属(Rhodotorulaspp.)等[12-13]。胶红酵母属子囊菌门、隐形酵母科、红酵母属,是单细胞真核生物[14-15]。随着基因组学和蛋白组学的发展,人们对胶红酵母产类胡萝卜素的代谢途径有了更清晰的认识。胶红酵母细胞经过一系列酶催化的环化、氧化、还原、异构化以及羟基化反应生成次级代谢产物类胡萝卜素(图1)[16-21]。

注:HMGR:HMG-CoA还原酶; ERG20:法尼焦磷酸合酶; EGR9:鲨烯合酶; CrtB:八氢番茄红素合成酶; CrtE:GGPP合成酶;

生物合成异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)有2种模块:甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)模块和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)模块[10,22]。其中胶红酵母细胞内类胡萝卜素的合成属于MVA模块,该合成反应发生在细胞质基质和内质网上,初始物质是乙酰CoA。胶红酵母产类胡萝卜素的代谢途径主要包括以下3个步骤:

(1)合成开始阶段。从碳源转化为丙酮酸,通过丙酮酸脱氢酶复合物转化为乙酰CoA;在HMG-CoA合成酶的催化下,将3分子的乙酰CoA转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A,HMG-CoA),紧接着转化为MVA;MVA经过磷酸化和脱羧作用合成IPP,即类异戊二烯的一般前体。

(2)番茄红素的合成阶段。IPP在异戊二烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI)的作用下,异构化为DMAPP;3分子的IPP按序添加到1个DMAPP中合成GGPP;GGPP在CrtYB催化下经缩合反应生成八氢番茄红素(C40胡萝卜素),然后在CrtI催化下得到番茄红素。

(3)番茄红素衍生出多种环状类胡萝卜素。番茄红素在一系列环化酶作用下,将其末端环化形成γ、β或δ环等。在CrtE、CrtB催化下,番茄红素依次环化生成δ-胡萝卜素和α-胡萝卜素;而在CrtY催化下,番茄红素环化生成γ-胡萝卜素,进而合成β-胡萝卜素,再在CrtZ、CrtW催化下生成虾青素。

番茄红素是合成途径的重要组成部分。提高β-胡萝卜素产量的关键是增加萜类的供应,防止麦角甾醇的生物合成,促进GGPP向下游方向转化[23]。

2 优化菌株培养策略

类胡萝卜素产量受菌株、培养基成分和培养条件等因素影响而有显著差异[24]。实现类胡萝卜素的大规模化生产策略,应重点从以下3方面开展:首先,驯化高产的红酵母菌株,使生物量高水平表达;其次,优化培养条件及发酵工艺,促进红酵母菌株生长;最后,从经济友好和生态健康的角度上,开发高效的方法破碎红酵母细胞和积累细胞色素[25-26]。

2.1 光诱导分析

生物体内类胡萝卜素的合成是一种光保护机制,类胡萝卜素可作为一种抗氧化剂,保护细胞免受紫外线伤害[27]。类胡萝卜素产量取决于光照时间和强度。光诱导与微生物生长有直接相关性,生物合成所必需的酶活性的提高会促进相关类胡萝卜素的积累[11,28-29]。

2.2 碳氮分析

在大多数酵母中,色素积累开始于对数阶段的后期,并持续在固定阶段,而合适的碳源和氮源对非生长阶段的类胡萝卜素的生物合成非常重要。碳氮比在(11～33)∶1范围内,类胡萝卜素产量差异不明显;但随着碳氮比的增大,类胡萝卜素产量下降。控制好培养基中碳源和氮源的质量浓度,可促进酵母生长和类胡萝卜素的积累。培养条件对胶红酵母产类胡萝卜素的影响如表1所示。

表1 培养条件对胶红酵母产类胡萝卜素的影响

吴永存等[37]利用好食脉孢菌与红酵母协同发酵玉米秸秆,采用正交实验优化了培养条件和发酵工艺,结果表明,20%的接种量(好食脉孢菌∶红酵母=1∶1)可显著提高类胡萝卜素产量。玉米秸秆的粗纤维含量高、蛋白质含量低,经好食脉孢菌和红酵母协同发酵后,玉米秸秆的营养价值明显提升,为生产功能性饲料提供了理论依据。利用豆类、水果及其它原料加工过程中的废弃残渣作为酵母发酵的碳源,可减少环境污染、实现废弃物的高值化利用。

2.3 金属元素分析

类胡萝卜素是一种抗氧化性色素,能有效清除O2和过氧化自由基。类胡萝卜素参与微生物的应激反应,其合成受到外源应激因素的影响,其中无机盐对维持培养基的稳态起到微缓冲作用。唐棠等[38]研究了8种无机盐组分对红酵母Y-5发酵产类胡萝卜素的影响,确定最优无机盐组分为KH2PO4、MgSO4和NaCl。

近年来,稀土元素的生物效应成为国内外的研究热点,尤为突出的是Hormesis效应[39],即毒理学上的“低促高抑”作用。稀土元素可能通过作用生物膜、酶分子、核酸等对微生物产生Hormesis效应。陈声明等[40]研究发现,LaCl3和NdCl3浓度在25～50 mg·L-1范围内时,对红假单胞菌产类胡萝卜素有较好的促进作用;而浓度高于75 mg·L-1时对红假单胞菌细胞生长有抑制作用,且随浓度的增加抑制作用增强。王怡平等[41]研究发现,稀土元素La3+、Ce3+、Nd3+在一定浓度范围内对红酵母代谢产类胡萝卜素有促进作用,当LaCl3浓度为20 mg·L-1时,类胡萝卜素含量提高了32.1%;当CeCl3浓度为5 mg·L-1时,类胡萝卜素含量提高了36.8%;当NdCl3浓度为50 mg·L-1时,类胡萝卜素含量提高了42.8%。在培养过程中用刺激物或诱导物适当处理有助于提高类胡萝卜素产量,这可能是由于金属作为辅助因子介导的激活(或抑制)特定关键酶的作用。

3 类胡萝卜素提取策略

类胡萝卜素的提取方法[42-43]如表2所示。

表2 类胡萝卜素的提取方法

其中超声波辅助酸热法的类胡萝卜素提取效果最优,其次是酸热水解法,其具有操作简单、成本低、对内溶物破坏小、破壁效果显著等特点,但对仪器设备的腐蚀性较强,需及时除酸。综合考虑工业化生产成本及操作条件等因素,目前最佳提取方法为酸热水解法。

4 利用基因工程手段定向改变策略

物理和化学诱变能提高突变率,而基因工程手段可以通过定向调控酶基因获得理想效果,进一步提高类胡萝卜素产量。Landolfo等[44]研究了胶红酵母C2.5t1合成胡萝卜素的CAR基因及基因簇的转录水平。 国内外学者从拟南芥(Arabidopsisthalina)、小球藻(Chlorellazofingiensis)、红法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)、欧文氏菌(Erwiniauredevora)、红酵母等生物体中克隆出了IPPI基因、DMAPP合成酶基因、crtYB基因等一系列与类胡萝卜素合成相关基因,深入研究其调控机理。基于代谢流中各个反应步骤中相应酶和产物关系以及编码基因相互间作用,以IPP-DMAPP为界,可将代谢途径分为上游和下游(图1),其中上游是MVA模块,HMG-CoA还原酶由hmg1和hmg2基因编码,被视为类异戊二烯途径的关键调控酶[45]。Wang等[46]在酵母诱变菌株K4中引入并过表达HMG-CoA还原酶基因hmg1,构建的转化子G1可使类胡萝卜素产量提高到16.98 mg·L-1;此外,麦角甾醇在合成FPP途径中与IPP产生竞争,通过阻断ERG9酶基因的表达使麦角甾醇的合成大大削弱,从而获得了类胡萝卜素高产工程菌。Shimada等[47]将欧文氏菌基因crtE、crtB、crtI分别与pgk、gal7、cap基因的启动子和终止子构建质粒转入到S.cervisiaeR7中,约10%的麦角甾醇进入到类胡萝卜素合成下游途径中。类胡萝卜素合成的异源表达与上下游模块中不同异源酶蛋白的表达处于相对统一时,才能使多基因功能的适配性与宿主细胞间的适配性达到最佳[10]。叶立军等[48]采用Golden Gate方法进行一次性多基因组装,将来源于P.agglomerans的4个功能基因crtE、crtY、crtI、crtB与不同强度的启动子结合构建质粒文库,同时调控多功能基因表达,β-胡萝卜素产量最高提高了65.2%。金应福等[49]通过引入番茄红素环化酶基因crtY构建β-胡萝卜素合成模块,并采用寡聚接头介导的DNA组装方法(oligo-linker mediated asembly method, OLMA)对CrtY的基因来源、表达水平等进行高通量优化,通过筛选获得β-胡萝卜素高产工程菌株。

除了调控代谢流,还可以通过敲除旁支基因使其更多流向次级代谢物。CRISPR-Cas9是近年来基因组工程中十分热门的基因编辑技术。汤皓等[50]构建了质粒p416-CAS9-gRNA,经基因编辑后可以高效敲除Cas9,不仅避免了Cas9对酵母中类胡萝卜素合成的影响,还提高了基因编辑效率。但以往关于胶红酵母产类胡萝卜素过程的报道,缺乏一些合成相关基因组功能注释,可能会影响利用胶红酵母提高类胡萝卜素产量的代谢效应。

5 结语

胶红酵母是有潜力的类胡萝卜素工业化生产菌株,但仅通过优化胶红酵母培养条件提升类胡萝卜素产量空间有限。随着生物技术的不断发展,对胶红酵母的潜力进行重新挖掘,使基因靶向和随机插入突变技术成为可能。近年来,CRISPR-Cas9系统用于菌株基因敲除方面的完善,对理解单基因和基因网络的功能及碳通量的管理具有重要意义。实时定量分析工具以及蛋白质组学的相结合,有望为工业水平上优化类胡萝卜素生产提供有用的工具,并将这些非常规酵母转化为方便的“细胞工厂”。