气质联用技术测定油茶籽中增塑剂方法学研究*

曾永明，周静萱，栾 洁，黄小芮，陈松武

(广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530002)

油茶籽是山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)油茶树的种子，油茶树有东方树美誉，是我国主要的木本油料树种，至今有2000多年的栽培和利用历史。茶籽油、茶树油或油茶籽油是从油茶籽中提取的不干性油脂，其脂肪酸的天然配比及组分与橄榄油相似，被称为东方橄榄油；另外，茶籽油中含有橄榄油所不具有的活性物质：茶多酚和山茶苷，其不饱和脂肪酸含量大于90%，且不含芥酸，比其它食用油更耐贮藏，不易酸败，因此茶籽油有长寿油和东方神油的美称。

最近，国家林业草原局、国家发展改革委、国家财政部联合印发《加快油茶产业发展三年行动方案(2023—2025年)》，明确3年新增油茶种植127.8万hm2(1917万亩)、改造低产林85万hm2(1275.9万亩)，确保到2025年，全国油茶种植面积达到600万hm2(9000万亩)以上、茶油产能达到200万t/a。我国油茶主要分布在长江中下游及以南地区，种植面积达437万hm2，以湖南、江西和广西油茶的种植面积最大，这3个省区总的种植面积占全国总种植面积的75%[1-2]。其中，广西共种植油茶面积45.3万hm2，约占全国油茶总面积的10. 4%，年产油茶籽25万t，茶油6.48万t，一二三产业综合总产值达180亿元，茶油种植面积、产量及产业产值均居全国第3位，平均单产名列全国第一位。广西油茶林主要集中在百色、柳州、河池、贺州4市，有20个县油茶面积超过 6667 hm2(10万亩)，其中三江侗族自治县面积最大，达到4.727万hm2(70.9万亩)，是中国油茶之乡和全国经济林(油茶)产业建设示范县[3]。

食品中持久性有机物(Persistent organic pollutants，POPs)之一的增塑剂邻苯二甲酸酯(Phthalate esters，PAEs)属于有毒化合物，会干扰人体内分泌，造成人体免疫力下降，对人身体有伤害。PAEs是由邻苯二甲酸与特定的酯反应产生的、具有软化作用的结构类似的持久性有机污染物[4]。PAEs与塑料基质之间以非共价键的形式结合，极易溢出，可通过各种暴露途径进入人体。经流行病学研究发现PAEs是一种明确的儿童持久过敏症的环境诱导剂[5]。PAEs还会造成儿童性早熟、损伤遗传基因、引起心血管疾病等。然而，我国目前还未真正实现食品生产过程中从农田到餐桌的全程监管，因此，市场监督和监测成了控制产品质量的最后一道关口，也是保障人民身体健康的最重要一道防线。监控油茶产业的持久性有机物污染问题是食品安全的关键因素，对于整个产业的稳定发展起着非常重要的作用。随着油茶产业的大力推广，油茶籽质量安全的问题引起政府和公众的重视。关于油茶籽中PAEs的检测方法尚未见报道[12～16]。由于油茶籽样品富含油脂、蛋白质和色素，基质复杂，故将PAEs从样品中分离富集出来成为决定分析结果可靠性的重要前提[10]。近年来，气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)技术已逐步应用于痕量有机分析[11]。本研究结合自身实验室和参与该项工作的实际情况，参照GB 5009.271—2016《食品安全国家标准 食品中邻苯二甲酸酯的测定》的要求[6]，运用多管漩涡混合比较了不同吸附剂对油茶籽基质的净化效果，建立了气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)(MRM)测定油茶籽中17种PAEs的分析方法，对PAEs的标准曲线、检出限/定量限、精密度、加标回收率一一进行方法验证研究。该方法操作简便，净化效果好，准确度高，对于进行油茶籽样品的PAEs监测具有重要意义，可作为食用林产品中PAEs日常检测的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备

Satorius CE622-1CCN 电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，TDZ5高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司、湖南)，IKAMS 3 basic旋涡混合器基本型(艾卡(广州)仪器设备有限公司)，M32全自动高通量平行浓缩仪(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)，GCMS-TQ8050NX气质联用仪(岛津(香港)有限公司、日本)。

1.1.2 化学试剂

无水硫酸镁(MgSO4，分析纯，上海麦克林生化有限公司)；十八烷基键合硅胶吸附剂(C18，粒径 45 μm，深圳逗点生物技术有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA，粒度 4 μm，深圳逗点生物技术有限公司)；多壁碳纳米管(NANO，粒径2～5 nm，上海麦克林生化有限公司)；弗罗里硅土(Florisil，粒度 4 μm，深圳逗点生物技术有限公司)；石墨化炭黑 (GCB，粒径38～120 μm，深圳逗点生物技术有限公司)；正己烷(色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司)；丙酮(色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司)；氯化钠(分析纯，西陇科学股份有限公司)；甲苯(色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司)；二氯甲烷(色谱纯，成都科隆化学品有限公司)；异辛烷(色谱纯，成都科隆化学品有限公司)。

1.1.3 标准物质

17种PAEs(邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP))混合标准溶液：2000 mg/L(上海安谱实验科技股份有限公司)，16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标：100 μg/mL(天津阿尔塔科技有限公司)。

1.1.4 试验样品

油茶籽样品采集于柳州市柳城县沙埔镇古仁村老古仁屯，新鲜油茶籽样品 2000 g。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理样品预处理，然后制得待分析样品

1)样品提取：多管漩涡混合-吸附剂净化方法。精准称取 10 g 研磨碎的油茶籽样品于 50 mL 离心管中，加入正己烷/丙酮(体积比9∶1)混合液 20 mL，均质 1 min，加入氯化钠 2 g，以 2500 r/min 的速度多管漩涡混合 2 min，以 5000 r/min 的速度离心 5 min，待净化。

2)提取液净化：取上清液 4 mL 于已预先装有 600 mg 无水硫酸镁(MgSO4)、100 mg 十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、100 mg N-丙基乙二胺(PSA)和 5 mg 多壁碳纳米管(NANO)的 15 mL 离心管中，以 2500 r/min 的速度多管漩涡混合 2 min，然后以 5000 r/min 的速度离心 5 min。取上清液 2 mL 到另一 15 mL 离心管中，在 40 ℃ 下氮气吹到近干，加入质量浓度为 5 μg/mL 的内标溶液 20 μL，再在 40 ℃ 下氮气吹至近干，用 1 mL 丙酮/异辛烷溶液(体积比1∶1)溶解，过 0.22 μm 有机滤膜，上气相色谱-三重四极杆串联质谱GC-MS/MS测定。

3)标准溶液配制：准确移取PAEs混合标准品 50 μL 于 10 mL 容量瓶中，用丙酮/异辛烷(体积比 1 ∶ 1)稀释，定容至 10 mL，充分摇匀，配制成17种PAEs标准中间液，再用空白基质溶液逐级稀释的方法，分别加入质量浓度为 5 μg/mL 的内标溶液 20 μL，配制成质量浓度为 0.00、0.02、0.05、0.10、0.20、0. 50 μg/mL 的PAEs标准曲线使用液，现配现用。

4)空白试验：除不加试验样品外，均按1)、2)测定步骤进行，操作过程中应避免接触塑料制品。

1.2.2 仪器条件

1)色谱条件：色谱柱：岛津Rtx-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：初始温度 60 ℃，以 40 ℃/min 升温至 150 ℃，保持 1 min，再以 10 ℃/min 升温 170 ℃，保持 1 min，再以 10 ℃/min 升温 220 ℃，保持 1 min，最后以 5 ℃/min 升温至 310 ℃，保持 3 min。进样口温度 290 ℃，载气为高纯氦气(99.999%)，流速 1.0 mL/min，不分流进样，进样量 1.0 μL。

2)质谱条件：离子源：电子轰击(EI)离子源，电离能量 70 eV，离子源温度 280 ℃，传输线温度 290 ℃，溶剂延迟 4 min。分别对17种邻苯二甲酸酯(PAEs)和16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标进行全扫描(Q3 Scan)，以化合物最大的m/z作为母离子；然后在全扫描数据组中调用产物离子(product)扫描方法，创建Product Ion Scan方法，优化碰撞电压，用最优碰撞电压对母离子进行再次裂解，确定m/z最大的子离子用于定性，根据各化合物的出峰顺序及母离子、子离子的m/z、碰撞电压等参数建立气相色谱-三重四极杆串联质谱GC-MS/MS多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方法。17种PAEs和16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标的质谱信息见表1。

表1 17种PAEs 的离子对信息、碰撞电压和保留时间

根据表1中各参数，得到PAEs污染物多反应监测(MRM)方法，将该方法设定在气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)中，每次测样时调出该方法，根据上述色谱和质谱设定的条件，将待测样品打入气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)中进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

影响提取回收率的关键因素是提取溶剂对目标物的溶解性大小，PAEs是一类弱极性化合物，根据相似相溶原理，优先选用常用的极性较弱试剂：正己烷、甲苯和二氯甲烷进行萃取[7]，研究了对空白样品加标(0.10 mg/kg)提取平均回收率的影响，结果见表2。实验结果表明，正己烷的提取效果最好。加入一定量的丙酮能够更好的提取PAEs，分别用正己烷/丙酮(体积比9∶1)和正己烷/丙酮(体积比1∶1)对上述加标样进行提取试验，发现提取效果相似，且均优于正己烷直接提取，但丙酮/正己烷(体积比1∶1)提取液中含有大量色素类杂质，提取液颜色较深。因此，本研究选择正己烷/丙酮(体积比9∶1)混合液作为PAEs的提取溶剂[8]。

表2 萃取溶剂对17种PAEs回收率的影响

2.2 QuEchERs净化条件的优化

油茶籽中PAEs提取液的干扰物含量较高，直接进样分析会污染仪器，同时会因极强的基质效应造成检验结果不准确。常用的净化吸附剂有十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、 N-丙基乙二胺(PSA)、多壁碳纳米管(NANO)、弗罗里硅土(Florisil)、石墨化炭黑 (GCB)等，其中PSA能去除样品中的有机酸、茶多酚和儿茶素类物质；C18能吸附非极性物质，可去除少量色素、甾醇、脂肪和维生素等；NANO、Florisil、GCB的添加均可吸附色素类物质，而NANO对色素的去除效果最优，因此选择C18、PSA、NANO作为净化吸附剂。影响 QuEchERs 净化效果的参数主要有吸附剂的用量、基质溶剂的种类、基质溶剂的用量、净化时间等；因此选取这几个因素，按照1.2.1的方法处理油茶籽样品，考察了添加 0.20 mg/kg 水平加标质量分数下的净化效果，以17种PAEs目标物的平均回收率为考察指标来确定最优化的QuEchERs 净化条件[8]。

2.3 提取净化条件的验证

选择了21份油茶籽空白样品分成3组进行低、中、高三种浓度加标，按照 2.1～2.2 中的方法验证提取和净化条件，结果(表3)表明每组油茶籽空白样品的加标优化结果相似，说明该前处理方法适用于实际油茶籽中PAEs检测。

表3 加标回收率试验数据

2.4 仪器条件的优化

2.4.1 色谱柱的选择

PAEs是一类弱极性化合物，根据相似相溶原理，本研究选择弱极性岛津Rtx-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)进行目标物的分离，实验结果表明17种邻苯二甲酸酯(PAEs)均得到了有效分离，且峰型尖锐对称。

2.4.2 质谱条件的选择

在确定各种PAEs的母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，分别选取丰度较强的主要碎片离子作为定量子离子，丰度次强的主要碎片离子作为参考定性子离子，通过优化碰撞能量、离子能量、质谱分辨率等质谱参数，使各种PAEs的基峰离子与特征碎片离子产生的离子对强度均达到最大。为优化质谱的参数，分别对17种PAEs和16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标进行全扫描(Q3 Scan)，以化合物最大的m/z作为母离子，有助于消除杂质的干扰；然后调用产物离子(product)扫描方法，创建Product Ion Scan方法，优化碰撞电压，对母离子进行再次裂解，确定m/z最大的子离子用于定性，根据各化合物的出峰顺序及母离子、子离子的m/z、碰撞电压等参数分别建成多反应监测(MRM)方法。选用(MRM)采集模式，一方面是因为它能够有效提高多种邻苯二甲酸酯(PAEs)的分辨率，降低假阳性的检出率，另一方面它具有专属性强，灵敏度高，抗干扰能力强，是目前最灵敏的 MS 模式，尤其适用于多种持久性有机污染物的测定[7]。根据欧盟2002 /657 /EC指令规定可知[9]，只需要选择两个或两个以上离子对作为确证点，就可准确定性定量。在选定的色谱条件下，利用气相色谱-三重四极杆串联质谱GC-MS/MS多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方式，对17种PAEs基质加标溶液进行进样分析，17种目标物均得到了良好的分离，且具有较高的灵敏度。

2.5 基质效应的消除

对于痕量检测来说，基质效应是定量分析中必须考虑的问题。基质效应评价主要以基质匹配标准曲线斜率和纯溶剂标准曲线斜率的比来确定的。当斜率比<0.9 时，为基质抑制效应；当 0.9≤斜率比≤1.1 时，基质效应可以忽略；当斜率比>1.1 时，为基质增强效应[7]。为了消除基质效应，本研究采用基质匹配标准曲线进行定量。

2.6 标准曲线

选取已知空白油茶籽样品，用1.2.1的前处理方法，得到基质提取液，再使用逐级稀释的方法制备与3)质量浓度一致的基质标准系列溶液，且分别加入质量浓度为 5 μg/mL 的内标溶液 20 μL，然后进行气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)(MRM)测定，以每种PAEs的质量浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表4，17种PAEs在各自线性范围内均呈良好的线性关系，线性相关系数均高于 0. 999。

表4 标准曲线参数表

2.7 方法检出限、定量限

对空白油茶籽样品加标 0.01 mg/kg 进行测试，以3倍信噪比为检出限(LOD)，10倍信噪比为定量限(LOQ)，17种PAEs的检出限(LOD)和定量限(LOQ)的计算结果见表5。

表5 检出限、定量限试验数据

2.8 回收率及精密度

在优化后的实验条件下，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱GC-MS/MS多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方式进行油茶籽空白样品加标回收试验，添加水平分别为0.02、0.10、0.50 mg/kg 三种不同质量分数，每个质量分数做7个平行，回收率计算结果详见表3。在3个不同添加水平下，17种PAEs的加标回收率为90.0%～115.0%，相对标准偏差(RSD)为0.2%～4.5%，表明方法的准确度和精密度均较好，见表6。

表6 精密度试验数据

2.9 实际样品检测

利用本研究建立的气相色谱-三重四极杆串联质谱GC-MS/MS多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)方法对2021～2022年抽检的其中6份油茶籽样品中的17种PAEs进行测定,所有样品均检出邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二环己酯(DCHP),质量分数范围为0.0012～0.23 mg/kg,检出率和检出含量均较高的项目包括邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二环己酯(DCHP),详见表7。

表7 油茶籽样品检测结果 mg/kg

3 结论

目前，针对不同种类的PAEs，检测人员会采用不同的检测方法确保检测结果的准确性，邻苯二甲酸酯类化合物依据标准GB 5009.271—2016，利用GC-MS采用离子扫描(SIM)法检测。本研究利用气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方式建立一种同时检测油茶籽17种PAEs持久性有机污染物的MRM方法，并且采用多管漩涡混合-吸附剂净化方法，可一次提取油茶籽中的17种PAEs，极大提高了检测的效率，节约了检测的时间成本。

17种PAEs在各自线性范围内均呈良好的线性关系，线性相关系数均高于0.999；实验测得检出限/定量限均小于方法中给出的最低检出限/定量限；分别对空白油茶籽样品加标0.02、0.10、0.50 mg/kg 三种不同质量分数平行测定7次，测得相对标准偏差(RSD)为0.2%～4.5%，<10%；17种PAEs的加标回收率为90.0%～115.0%；方法学参数验证良好。该方法应用于实际样品测定，平行性好，准确度好，灵敏度高[10]，适用于批量样品处理，可用于不同油茶籽样品中PAEs的日常检测工作和实验基地样品监测。

本研究进行了真实样品采集、处理及检测，检测过程采取了有效的质量控制措施，检测过程均符合要求，检测结果准确。通过验证研究，该方法的标准曲线、检出限/定量限、精密度和准确度均满足方法学要求。