基于网络药理学探究肉桂精油的抗氧化性作用机制*

董宏伟，涂清波

(南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300)

肉桂(Cinnamomum cassia Presl)是樟科樟属植物的一种常绿树，具有较高的医用和食用价值。《本草纲目》记载肉桂具有“补下焦不足，治沉寒痼冷之病，渗泄止渴，去荣卫中风寒，表虚自汗”等功效。我国是肉桂原产地和种植大国，国内资源丰富及产量巨大。肉桂精油是从桂皮、桂枝、桂叶等部位提取的芳香味油状液体。现代药理表明[1]，其具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌等多种生物活性。中药治疗疾病存在多成分、多靶点、多通路同时作用的特性[2]。氧化应激是一种生物体内部产生的自由基和活性氧物质引起的一系列有害生理过程[3]，会导致脂质过氧化、蛋白质损伤、DNA断裂等多种细胞损伤，进而引起许多疾病，如心血管疾病、肿瘤等。肉桂精油的抗氧化作用明确，但其具体的作用机制研究还不够清楚。网络药理学适用于中药复杂成分的解析和开发[4]，可对肉桂精油抗氧化的作用机制进行系统全面的分析。本研究运用气质联用和网络药理学对肉桂精油活性成分、作用靶点、信号通路等进行系统分析，初步探究肉桂精油的抗氧化机制，为其进一步药理研究和产品开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

桂皮粉为食品级，购自泰州市邦蓝食品有限公司；甲醇为色谱级，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 肉桂精油化学成分分析

根据刘彤[5]等提取方法稍加修改，称取 100 g 肉桂粉置于 1 L 烧瓶中，加入 600 mL 蒸馏水回流提取 2 h，收集得到肉桂精油。运用气质联用技术(GC-MS)[6]。简单地说，用色谱甲醇稀释肉桂精油，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后进气相色谱，色谱柱为HP-INNOWax polyethylene glycol(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，载气为氦气，流速为 2.0 mL/min。设置 40 ℃ 开始保温 2 min，5 ℃/min 升高至 240 ℃，保持 18 min，注射口温度为 250 ℃，分流比为20∶1。电离源和传输线的温度分别为230 ℃和250 ℃，离子能量为 70 eV，质量范围为40～400 Da。

1.3 肉桂精油活性成分对应靶点的获取

利用TCMSP数据库检索肉桂精油主要化学成分的对应靶点[7]，通过Pubchem数据库，获得主要成分的SMILE Name，并导入SWISS Taget Prediction数据库中，获取单个主要成分的Gene名。

1.4 肉桂精油抗氧化相关靶点的收集

在Genecards疾病数据库中，以“Anti-oxidant”为关键词，在Genecards数据库中检索并获取对应靶点[8]，从而获得与抗氧化相关的靶点信息，去除重复值，汇总抗氧化的相关靶点。将药物和疾病靶基因取交集，获得两者的共同靶点基因，绘制Venn图。

1.5 蛋白质相互作用网络的构建及可视化分析

将共同靶点数据集导入String数据库[9]，得到蛋白质相互作用网络，通过运用Cytoscape软件构建“药材-成分-靶点”可视化、多元素、多水平间的作用关系。网络中各节点分别代表活性成分和关键靶点基因；网络中边用来连接活性成分与关键靶点基因；连接到网络的节点以度值为单位进行表示。某节点与其他节点连接的边数越多，则说明该节点在网络中扮演的角色越重要，度值也越大。

1.6 GO与KEGG富集分析

对筛选得到的化合物对应的潜在靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析[10]，GO富集分析选择生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)3个模块，通路分析选择KEGG，设定p<0.05，选取物种为人类，通过KEGG分析可以得到肉桂抗氧化的潜在作用通路。

1.7 “活性成分-核心靶点-通路”网络图的构建

将涉及的活性成分与通路及其相关靶点导入Cytoscape软件得到“活性成分-核心靶点-通路”网络[11]，计算网络中成分节点进行拓扑分析，反向筛选肉桂精油抗氧化的有效成分及关键基因。

2 结果与分析

2.1 肉桂精油化学成分分析

经GC-MS和NIST标准数据库对比分析，肉桂精油的化学成分包含36个化学物质(α-蒎烯、莰烯、1，2-二甲基-3-(1-甲基乙烯基)环戊烷、3，7，7-三甲基双环[4.1.0]庚烷、邻薄荷-8-烯、3-蒈烯、1，4-桉叶素、o-环己烯、D-柠檬、桉树醇、苯甲醇、双戊烯、1，3，3-三甲基双环[2.2.1]庚烷-2-氧、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、反式-1-乙烯基-2-甲基环己烷、水杨酸甲酯、反式肉桂醛、9-甲氧基双环[6.1.0]壬-2，4，6-三烯、巴伦西亚橘烯、2，3，4，7，8，8a-六氢-3，6，8，8-四甲基-1H-3a，7-亚甲基薁-5-甲醇、苯甲酸苄酯、N-(1-甲基乙基)-苯甲胺、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、肉桂酸苄酯、[2-甲基-2-(4-甲基-3-戊烯基)环丙]-甲醇、α-紫罗兰酮、甲位异丁酸松油酯、鸢尾酮、2，4，5-三甲基苯乙醛、(+)-3-蒈烯、环氧石竹烯、1R，4R-对-甲基-2，8-二烯-1-过氧化氢、1，2-二甲基-1，2-乙二醇、顺-7-十四烯醛、(E)-6-十六碳烯-4-炔)，其中峰面积比大于1%的主要成分有5个，分别是反式肉桂醛(74.42%)、邻苯二甲酸二丁酯(8.28%)、水杨酸甲酯(4.51%)和邻苯二甲酸二异丁酯(4.05%)和鸢尾酮(1%)。

2.2 活性成分靶点网络的构建

肉桂精油36个化学成分对应的潜在药物靶点为185个。构建的活性成分靶点网络如图1所示，共有108个节点(91个基因靶点，1个中药名称节点和16个成分节点)150条边。根据自由度对活性成分进行排序，主要活性成分分别是甲位异丁酸松油酯、邻苯二甲酸二异丁酯、肉桂酸苄酯、α-紫罗兰酮、反式肉桂醛。

图1 药物-成分-靶点相互作用图(其中，黄色代表活性成分，蓝色代表靶点)

2.3 抗氧化靶点和核心靶点的获取

将Genecards数据库收集到的靶点合并去除重复后，得到肉桂精油成分靶点和抗氧化相关靶点的维恩图如图2所示，抗氧化的靶点有2038个，肉桂精油中活性成分对应的靶点和抗氧化对应的靶点的交集靶点有91个。

图2 肉桂精油成分靶点和抗氧化相关靶点的维恩图

2.4 蛋白质相互作用网络的构建

将交集靶点导入STRING据库后，构建蛋白质相互作用网络如图3a所示，其中抗氧化交集靶点网络结构图中有91个节点，591条边线组成。通过Cytoscape软件中的Betweenness、Degree和Closeness算法依次取前50%筛选出肉桂抗氧化的核心靶点，如图3b所示，肉桂活性成分中抗氧化的核心靶点有10个，分别为CASP3、PTGS2、EGFR、HIF1A、STAT3、TLR4、ESR1、APP、RELA、PPARA。

图3 a：肉桂精油抗氧化核心靶点PPI网络；b：肉桂精油活性成分靶点与靶点互相关系

2.5 关键靶点的GO功能注释和KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库，对10个肉桂精油活性成分抗氧化靶点基因进行GO和KEGG功能富集分析。GO注释如图4所示，富集BP、CC、MF、的富集条目一共有546个。其中BP的条目主要有379个，富集主要部位在细胞膜上，主要涉及细菌的免疫原性和致病性。CC的主要条目有60条，主要涉及细胞的代谢和信号转导，蛋白质合成与折叠，物质运输。MF主要条目有107条，主要涉及酶催化的速率、底物选择性以及酶的稳定性。经KEGG通路富集分析，得到肉桂精油抗氧化的潜在作用通路共获得132条通路，按P值按照降序排列，排名前十的信号通路制作气泡图，如图5所示。气泡点的大小表示相应功能通路中靶基因的数量，富集度表示属于该通路中所有被注释基因的靶基因数量的比率。P值越低、颜色越红代表KEGG富集程度更高。表明TNF、FoxO、C-type lectin receptor、PD-L1等信号通路在肉桂精油抗氧化中起主要作用，糖尿病性心肌病通路被认为是一组关键通路。肉桂精油抗氧化的关键靶点富集在：多巴胺能突触、糖尿病性心肌病、细胞凋亡、肿瘤坏死、生长激素缺乏症等相关途径和通路中。

图4 肉桂精油抗氧化核心靶点的GO富集分析

图5 肉桂精油抗氧化核心靶点的KEGG富集分析

2.6 成分-靶点-通路的网络构建

将核心靶点及其相关的活性成分与前20条通路及其相关靶点导入Cytoscape软件。删除16条重复得到“活性成分-核心靶点-通路”网络如图6所示，该网络包括192个节点(其中包括化合物16个，91个靶点，10个通路网络)267条边。从通路角度来看，连接度较高的为hsa04728、hsa05415。从靶点角度分析筛选出6个DC≥10的靶点，分别为MAPK11、PIK3CA、CYP19A1、PIK3CA、MAPK14、MAPK10。从化合物角度来看，共筛选出5个主要化合物，分别为甲位异丁酸松油酯、邻苯二甲酸二异丁酯、肉桂酸苄酯、α-紫罗兰酮、反式肉桂醛。肉桂精油中存在多成分作用于一个靶点，成一个靶点作用于多个成分，也存在一条通路多个靶点，或不同通路同属于一个靶点的现象，表明肉桂精油通过多成分、多靶点、多通路方式的抗氧化作用。

图6 成分-核心靶点-通路网络

3 结论

植物精油因其良好的生物活性、安全性、渗透性和生物降解性，被广泛应用于医药化工、食品工业和化妆品行业中。本文运用气相色谱-质谱联用和网络药理学的方法，发现肉桂精油主要成分为36个，筛选出对应靶点185个，疾病靶点2038个，共有靶点91个，涉及546个基因功能条目和132条通路。经“活性成分-核心靶点-通路”网络分析，筛选出5种核心成分、6个核心靶点以及2个连接度较高的信号通路，说明肉桂精油可通过多种成分、多个靶点以及不同通路的来实现其抗氧化作用，初步探讨了肉桂精油的抗氧化作用机制，为后续药理研究和产品开发提供科学依据。