气相色谱-质谱法测定豇豆中倍硫磷亚砜含量不确定度

◎ 王 儒，张欣琪，王 婷，张 乐，林达峰，梁 琼

（海南省食品药品检验所海口分所，海南 海口 570311）

豇豆属于豆科豇豆属，别名为豆荚、角豆、带豆，全国各省市均有种植[1-2]，热带和亚热带地区种植居多[3]。豇豆生长过程易受病虫危害，因此，种植人员会使用农药控制多种病虫害[4-5]，农药残留风险突出[6-8]，2022年，市场监管总局通告豇豆主要农药残留超标物[9]包括倍硫磷农药等。倍硫磷是一种触杀、广谱、持效期长的有机磷杀虫剂，可杀死多种害虫，如大豆食心虫、果树害虫、蔬菜害虫等。虽然倍硫磷对人体低毒，一旦残留量超标，也会引起中毒现象。有机磷类药物中毒时，轻度会恶心、头疼，重度出现昏迷、抽搐等[10]。

2021 年3月3日，最新发布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）[11]规定豇豆中倍硫磷最大残留限量为0.05 mg/kg，通常为倍硫磷、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜加和计，其中，倍硫磷亚砜是日常检测时较为常见的一种检出形式。此外，GB 2763—2021 规定，豇豆中倍硫磷亚砜留量的检测方法有气相色谱串联质谱法[12-13]、液相色谱串联质谱法[14]。

豇豆是日常抽检果蔬品种之一，因此，本研究采用了气质谱联用法[15-17]，参考了不确定度评定相关标准进行不确定分量的分析，如《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[18]、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[19]、《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[20]、《常用玻璃量器检定规程》 （JJG 196—2006）[21]，并按照GB 23200.113—2018 规定，对豇豆中倍硫磷亚砜留量进行不确定评定，旨在提升评定结果的准确性，更好地满足日常检验工作质量控制的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

（1）材料。乙酸乙酯色谱纯（美国飞世尔公司）；乙腈色谱纯（美国飞世尔公司）；提取试剂包：4 g硫酸镁 ＋ 1 g 氯化钠 ＋ 1 g 柠檬酸氢二钠 ＋ 0.5 g 柠檬酸钠（逗点生物科技有限公司）；净化试剂包：900 mg硫酸镁＋150 mg乙二胺基-N-丙基（PSA）（逗点生物科技有限公司）。

（2）设备。美国安捷伦 7000C气质联用仪；QUINTX224-1CN电子分析天平：允许偏差为±0.000 5g；100 μL移液枪：允许偏差为±8%（即±8 μL）；1 000 μL移液枪：允许偏差为±1%（即±10 μL）；5 000 μL移液枪：允许偏差为±1%（即±50 μL）；10 mL单标线吸管：允许偏差为±0.020 mL；25 mL分度吸管：允许偏差为±0.030 mL；50 mL分度吸管：允许偏差为±0.10 mL；1 mL A级容量瓶：允许偏差为±0.010 mL；5 mL A级容量瓶：允许偏差为±0.020 mL；10 mL A级容量瓶：允许偏差为±0.020 mL；环境温度为20 ℃±5 ℃；

标准品：倍硫磷亚砜（编号/批号22873YB/F0034453），曼哈格科技股份有限公司，浓度为1 001.3 μg/mL，扩展不确定度为±3%（K=2）。

1.2 试验方法

（1）准确称取10 g样品，用10 mL乙腈、1.1中的提取试剂包提取，盖上离心管盖后剧烈振荡5 min，低速离心。离心后吸取上清液6 mL加到1.1中的净化试剂包塑料离心管中，低速离心，净化后上清液2 mL到干净试管中40 ℃氮吹至近干。加入5 μg·mL-1环氧七氯内标20 μL，并加1 mL乙酸乙酯，震荡混匀后过微孔滤膜（0.22 μm）测定。

（2）空白基质溶液按上述方法氮气吹干后，加入5 μg/mL环氧七氯内标20 μL，加入浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 μg·mL-1和0.5 μg·mL-1的梯度溶液1 mL复溶，制成混合基质标准工作溶液（曲线），震荡混匀后过微孔滤膜（0.22 μm）待测。

（3）气相色谱串联质谱测定条件。①气相色谱条件：HP-5 MS（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氦气（纯度为99.99%），不分流进样，进样量1 μL，流速为1.0 mL·min-1；进样口温度为280 ℃；程序升温：40 ℃（保持 1 min）， 40 ℃/min 升至120 ℃（保持 0 min）， 5 ℃/min 升至 240 ℃（保持0 min），以 12 ℃/min 升至 300 ℃（保持 5 min）。②质谱条件：EI源能量 70 eV ；离子源温度：250 ℃；接口温度：280 ℃；扫描方式：多反应监测；内标外环氧七氯监测离子对（m/z）为352.8 ＞253.0，354.8＞253.0；倍硫磷亚砜监测离子对（m/z）为278.0＞109.0，278.0＞169.0。

（4）结果计算。通过计算机按内标法的公式进行计算：

式中：X——试样中待测物残留量，mg·kg-1；

Cs——基质曲线标准工作溶液中待测物的浓度，μg·mL-1；

A——试样溶液中待测物的色谱峰面积；

As——基质曲线标准工作溶液中待测物的色谱峰面积；

Ci——试样溶液中内标物的浓度，μg·mL-1；

Csi——基质曲线标准工作溶液中内标物的浓度，μg·mL-1；

Asi——基质曲线标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；

Ai——试样溶液中内标物的色谱峰面积；

V——样液最终定容体积，mL；

m——试样溶液所代表试样的质量，g。

2 不确定度来源分析

①天平引入的标准不确定度u（m0）（m0为样品质量）。②待测物倍硫磷亚砜浓度引入u（ccs），主要包括倍硫磷亚砜标准物质本身相对标准值引入u（ucs）、配制过程引入u1（c）（倍硫磷亚砜标准溶液），建立拟合标准曲线时引入u2（c）。③体积引入u（V1）（V1为测定用样液）。④体积引入u（V2）（V2为试样处理液吸取体积）。⑤定容体积V3引入u（V3）（V3为试样处理液定容体积）。⑥多次测量重复性引入u（rep）。

3 不确定度分量的量化

3.1 天平引入的标准不确定度u（m0）（m0为样品质量）

天平称重豇豆10.00 g，天平最大允差为0.000 5 g。假定服从矩形模型分布，则天平标准不确定度：

天平使用2次，一次为去皮，一次毛重。

称取10.00 g样品时，天平引入的相对标准不确定度：

3.2 试料溶液中被测物的倍硫磷亚砜浓度引入的标准不确定度u1（c）

倍硫磷亚砜（编号/批号22873YB/F0034453），浓度为1 001.3 μg·mL-1，扩展不确定度为±3%（K=2），倍硫磷亚砜溶液标准物质本身引入的相对标准不确定度：

3.2.1 倍硫磷亚砜稀释时引入的不确定度

（1）倍硫磷亚砜标准品配置，溶剂为丙酮，母液为1 001.3 μg·mL-1。

第1次稀释：规范使用1 000 μL移液枪和10.00 mL容量瓶，将母液稀释10倍得到浓度为100.13 μg·mL-1。第2次稀释：规范使用1 000 μL移液枪和10.00 mL容量瓶，逐级稀释10倍，得到浓度为10.013 μg·mL-1。

假定移液器与容量瓶的容量允差和环境影响2个因素引入的不确定度均服从矩形分布k=3，参考依据为JJG 646—2006和JJG 196— 2006中允差值见1.1 材料与设备，有机溶剂的体积膨胀系数为1.0×10-3℃-1。

①1 000 μL的移液管

移液管容量允差引起的体积标准不确定度：

环境温度引入的标准不确定度：

1 000 μL的移液管相对标准不确定度：

②10 mL A级容量瓶

10 mL 容量允差引起的体积标准不确定度：

环境温度引入的标准不确定度：

10 mL A级容量瓶相对标准不确定度：

标准溶液第1次稀释过程中引入的相对标准不确定度：

第2次稀释过程中容量器具引入的不确定度：

（2）与1.2中标曲配置过程相同，内标为外环氧七氯，因标曲和样品中均加入内标，内标加入过程引入的不确定度可忽略。

①100 μL的移液管

容量允差带来的体积标准不确定度：

环境温度引入的标准不确定度：

100 μL的移液管引入的相对标准不确定度：

②5 mL A级容量瓶

5 mL A级容量瓶容量允差引起的体积标准不确定度：

环境温度所引入的标准不确定度：

5 mL A级容量瓶相对标准不确定度：

标准溶液第3次稀释时引入的相对标准不确定度：

3.2.2 工作曲线计算机拟合时引入的标准不确定度u2(c)

由于工作曲线用计算机拟合时使用了内标校正，标准曲线建立时计算机计算模式：以基质标准工作液浓度ci（μg·mL-1）与相应内标物的浓度csi（μg·mL-1）的比值为横坐标c，以基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积As与相应内标物的色谱峰面积Asi的比值相对响应为横坐标Ai（见表1）。

表1 倍硫磷亚砜标准溶液c与相对响应表

进行工作曲线校准和在线曲线拟合过原点，标准曲线为线性方程A=ac+b, 斜率为a=0.822 120,截距为b=0.024 61，相关系数r=0.995 468 07。

式中：s——曲线的标准差，由公式进行计算；

p——待测溶液的测定次数，p=2；

n——标准曲线建立时曲线测定总次数，每个标准点测定1次，共7个点，n=7；

a——曲线的斜率，值为0.822 120；

b——曲线的截距，值为0.062 461；

c——基质标准工作液浓度ci（μg·mL-1）与相应内标物的浓度csi（μg·mL-1）的比值；

——基质标准工作液浓度ci（μg·mL-1）与相应内标物浓度csi（μg·mL-1）比值的平均值；

ci——建立工作曲线用标准系列基质标准工作液浓度ci（μg·mL-1）与相应内标物浓度csi（μg·mL-1）的比值；

Ai——建立工作曲线用标准曲线中基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积As/相应内标物的色谱峰面积Asi的比值相对响应。

根据以上数据求得，s=0.096 7，c=2.367 ；内标浓度为0.1μg·mL-1，c转换成样品浓度为0.236 7 μg·mL-1；工作曲线计算机拟合时引入的标准不确定度u2（c）=0.094 6；相对标准不确定度为urel（c2）=0.094 6/2.367=4.0%。

综合试料中倍硫磷亚砜的计算机拟合曲线过程相对标准不确定度为u（c）：

3.3 样品溶液稀释定容体积V引入的标准不确定度u（V）

步骤为1.2中样品稀释过程，此处用到10 mL移液器和5 000 μL移液枪2次，因内标物添加时样品和标样均用同一把移液枪，该内标加入过程引入的不确定度可忽略。

3.3.1 10 mL的移液管

移液管容量允差引起的体积标准不确定度：

环境温度引入的标准不确定度：

100 μL的移液管相对标准不确定度：

3.3.2 5 000 μL的移液管

移液管容量允差引起的体积标准不确定度：

环境温度引入的标准不确定度：

5 000 μL的移液管相对标准不确定度：

体积相对标准不确定度u（V）：

3.4 测量结果多次重复性引入的标准不确定度u（rep）（见表2）

表2 多次重复性引入的标准不确定度结果表

由贝塞尔公式计算得到s（A）单次测量相对标准差为0.046，测量结果为2次取平均值，则u（rep）为：

4 合成标准不确定度的计算

测定过程中的数值与不确定度分量见表3。

表3 测定过程中的数值与不确定度分量表

将表中的不确定度分量合成：

样品中倍硫磷亚砜含量取前2个样的平均值，最终测定结果为0.24 mg·kg-1,因此：

扩展不确定度：U=Ku（w）=2×0.017=0.034 mg·kg-1（95% 置信概率下，取包含因子k=2 ）。

样品中倍硫磷亚砜含量：（0.24±0.034） mg·kg-1，k=2。

5 结论

本研究按照国家标准 GB 23200.113—2018[13]，对豇豆中倍硫磷亚砜残留量进行测定，按照试验步骤，对实验过程中不确定度来源进行了分析。结果显示，倍硫磷亚砜标准溶液的配制过程，以及标准曲线的计算机拟合过程中引入的不确定度分量＞测试结果多次重复性不确定度分量＞样品试验稀释过程引入的不确定度分量＞样品称样过程的不确定度分量。因此，在检验时，工作人员需定期校准容量瓶移液管等玻璃量器和移液枪等设备，并严格按试验操作规程使用仪器设备，以减少试验过程引入的不确定度，提高检测结果的准确性。