健脾清化化瘀汤对幽门螺杆菌相关胃癌前病变大鼠胃黏膜miR-21、PTEN表达的影响

李一桐 汪红兵

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一。据流行病学报道,我国每年胃癌死亡病例数量超过全球胃癌死亡总病例的8.2%[1]。胃癌前病变是一种病理状态,一般包括肠上皮化生和上皮内瘤变,主要存在于慢性萎缩性胃炎,是炎—癌转化的关键环节。上皮内瘤变又称异型增生,慢性萎缩性胃炎伴异型增生是目前公认最主要的胃癌前病变。延缓胃癌前病变向胃癌进展,是减少胃癌发病率的重要手段之一。

研究发现,miR-21作为一个致癌的miRNA,常在多种肿瘤细胞中呈异常表达,通过干扰miR-21的表达可在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长[2-3]。磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)基因作为一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,已经实验证实为miR-21的靶基因之一[4-5]。多种研究证实,下调胃癌组织中PTEN的表达可引起磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途径(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B pathway,PI3K/Akt)的激活,促进癌细胞增殖[6-7],而PTEN的上调可显著抑制肿瘤增长[8]。miR-21、PTEN在胃癌发生发展过程中发挥重要作用,可能是治疗胃癌前病变,阻断胃癌前病变向胃癌发展的潜在新靶点。

健脾清化化瘀汤是国家级名老中医李乾构教授的经验方,临床主要用于治疗幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)相关性慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)伴异型增生(dysplasia,Dys)。基于课题组前期研究结果,本实验采用甲基-N-硝基-N亚硝基胍(MNNG)联合HP感染、雷尼替丁、饥饱失常法建立CAG伴Dys大鼠模型,运用苏木精—伊红(hematoxylin and eosin staining,HE)染色、免疫组化法、RT-PCR法等方面观察健脾清化化瘀汤对CAG伴Dys大鼠胃黏膜的影响,探讨miR-21、PTEN与胃癌前病变的相关性,为中医药治疗HP感染相关CAG黏膜异型增生提供新的方法和途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠90只,5周龄,体质量约(150±10)g。购于北京华阜康生物科技有限公司,动物合格证号:1103221911001532,生产许可证号:SCXK(京)2014-0004。于首都医科大学附属北京中医医院研究所动物房内屏蔽环境下进行分笼饲养,室温20～26℃,相对湿度40%～70%,自然昼夜节律,12小时光照和12小时黑暗循环进行。适应性喂养1周后进行实验。

1.2 药物制备

健脾清化化瘀汤组成:党参10 g、丹参10 g、莪术15 g、白术15 g、茯苓15 g、甘草5 g、黄连5 g、大黄6 g、蒲公英20 g、白花蛇舌草20 g、三七3 g、土茯苓15 g、陈皮10 g、半夏曲10 g(生产厂家:北京太洋树康药业有限责任公司、北京杏林药业有限责任公司,生产批号为18081403、18060502等)。经标准化自动煎药机煎煮后供实验所用。根据《药理实验方法学》中规定,中药灌胃剂量按60 kg成人剂量与大鼠体质量比率换算法计算,以8.35g/(kg·d)作为低剂量组、16.70 g/(kg·d)作为中剂量组、33.39 g/(kg·d)作为高剂量组。

1.3 主要试剂及仪器

HP菌株(运用国际统一的悉尼菌株 1标准菌株,由中国疾病预防控制中心提供);雷尼替丁胶囊(东京化成工业株式会社,批号:PQR8E-HF);MNNG(日本东京化成工业株式会社,批号:2MTHL-PO);氨基胍(梯希爱化成工业发展有限公司,批号:BQFLB-PQ);SYBR Green试剂盒(天根生化科技有限公司,批号:U8910);cDNA转录试剂盒(天根生化科技有限公司,批号:U9116);TRIZOL裂解液(日本TAKARA BIO INC,批号:207002);PTEN一抗(上海碧云天生物技术有限公司,批号:061220210104);通用二步法试剂盒(小鼠/兔增强聚合物法检测系统)(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:2130D0104)。

HE半自动染色仪(德国Leica公司,AUTOSTAINERXL);轮转切片机(德国Leica公司,RM2130);组织脱水机(德国Leica公司,TP1020);组织包埋机(德国Leica公司,EG1140H);石蜡烤片机(德国Leica公司,HI1220);分光光度计(新发现科技有限公司,22331);PCR扩增仪(美国ABI,8A,250VAC,SBCT);7500定量PCR仪(美国ABI,7500 Real-Time PCR);PCR热循环仪(美国ABI,2720);细菌培养箱(广州市华粤行仪器有限公司,DWS-A35)。

1.4 大鼠饲料

大鼠普通饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。造模使用的0.03%雷尼替丁饲料由普通饲料添加0.03%盐酸雷尼替丁制成,由北京华阜康生物科技有限公司制作。

1.5 分组与动物模型建立

90只SD大鼠,按照随机数字表法随机分为6组,包括正常组、模型组、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抑制剂组、健脾清化化瘀汤高剂量组、健脾清化化瘀汤中剂量组、健脾清化化瘀汤低剂量组,每组15只。

除正常组外,其余5组每只大鼠均用HP菌液灌胃。HP菌液灌胃前,大鼠自由饮用5 mg/mL链霉素溶液3天,便于HP定植。灌胃前6小时,给予每只大鼠2 g/L吲哚美辛NaHCO3溶液灌胃2 mL。灌胃用HP菌液浓度1x109CFU/mL,每只大鼠灌胃2 mL。平均2次/周,共灌胃7次。第7次HP菌液灌胃结束后,给予大鼠正常食水2周,以便于HP定植,2周后对大鼠进行13C尿素呼气实验,以确认HP成功定植。确认大鼠HP定植成功后,除正常组外,其余5组大鼠予150 μg/mL MNNG溶液灌胃,每只大鼠每次灌胃3 mL,平均5次每周。同时予100 μg/mL MNNG溶液自由饮用(避光保存,隔天换一次),配合饥饱失常法(2天足量饲料喂养,1天禁食不进水),5组大鼠均予0.03%雷尼替丁饲料喂养,持续造模28周。造模第8、16、20、24、28周,分别随机取材5只观察胃黏膜病理改变,以评价造模情况(除取材的大鼠外,实验过程中正常组、模型组、iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组大鼠死亡数量分别为2只、5只、4只、5只、3只、4只)。

1.6 干预及取材

造模成功后,正常组、模型组给予普通饲料及饮用水,生理盐水灌胃,日1次;健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组给予相应剂量中药灌胃治疗,日1次;iNOS抑制剂组给予氨基胍溶液50 mg/(kg·d)剂量进行灌胃干预,日1次。干预均持续10周。

灌胃给药10周末进行大鼠取材及标本收集。干预结束后,正常组、模型组、iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组存活大鼠的数量依次为:13只、5只、6只、5只、7只、6只。(正常组采用随机数字表法抽取7只进行组织学检测及分子生物学检测)。采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处死大鼠。摘离大鼠全胃取出,沿胃大弯剪开,运用生理盐水冲洗胃内容物。一部分组织固定于4%多聚甲醛内48小时,存放于4℃冰箱,用于HE染色及免疫学检测;另取部分胃组织置于EP管中,置于液氮中,后转存于-80℃超低温冰箱冻存,用于分子生物学检测。

1.7 检测指标

1.7.1 胃组织病理学 采用HE染色观察,取多聚甲醛固定的胃组织,脱水透明后石蜡包埋。将蜡块切成5 μm厚度的切片,固定于载玻片。按照常规HE染色步骤进行染色、脱水、透明、中性树胶封片。运用光学显微镜观察胃黏膜病理学变化。

1.7.2 免疫组化法 检测胃组织PTEN蛋白表达情况。将制好的石蜡切片进行脱蜡和水化:二甲苯20分钟(2次)、无水乙醇3分钟(3次)、95%乙醇3分钟(2次)、75%乙醇3分钟(2次)、蒸馏水1分钟,柠檬酸缓冲液中100℃水浴20分钟,冷却至室温。滴加内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育10分钟。滴加正常山羊血清封闭,37℃孵育30分钟。加一抗,4℃冰箱孵育过夜。PBS缓冲液冲洗3次,滴加反应增强液,室温孵育20分钟。滴加二抗,室温孵育2分钟。冲洗后滴加DAB工作液,室温孵育4.5分钟。洗涤后苏木素染色20秒,冲洗。脱水、透明,中性树胶封片,显微镜下阅片。

1.7.3 荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR) 检测胃组织miR-21、PTEN mRNA的表达情况。运用Trizol法提取总RNA,测定260 nm、280 nm OD值。利用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA。以其为模板,采用SYBR Green荧光定量试剂盒进行PCR扩增反应,检测相关基因的表达情况。以GAPDH作为PTEN的内参基因,以U6作为miR-21的内参基因,引物序列见表1。运用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠胃组织病理形态学变化比较

正常组:胃黏膜上皮细胞排列规律,腺体排列紧密整齐,呈单层柱状上皮,细胞形态大小均一,无明显慢性炎性细胞浸润。模型组:胃黏膜上皮层变薄,腺体排列紊乱,固有腺体萎缩消失, 腺管结构不规则,固有层内可见淋巴细胞、浆细胞浸润,局部可见细胞核异型性,细胞核固缩深染,部分可见局灶性肠上皮杯状细胞。iNOS抑制剂组:胃黏膜上皮层变薄,腺体萎缩,腺体排列尚规则,但仍会出现紊乱状态,形状不规则,局部可见少量杯状细胞,固有层可见炎性细胞浸润,总体较模型组减轻。健脾清化化瘀汤低剂量组:胃黏膜上皮层变薄,固有腺体萎缩,排列紊乱,结构不规则,固有层可见淋巴细胞浸润,间质少量红细胞,可见杯状细胞及核深染,总体较模型组稍有减轻,但好转不明显。健脾清化化瘀汤中剂量组:胃黏膜腺体排列较为规律,腺体轻度萎缩或无明显萎缩,胃小凹完整,腺上皮和腺管分界较清,黏膜浅层炎性细胞浸润,固有层可见散在淋巴细胞,细胞形态较均一,总体改善最佳。健脾清化化瘀汤高剂量组:黏膜炎症较模型组及中药低剂量组轻,较中药中剂量组重,腺体排列尚规律,可见中性粒细胞浸润,镜下可见胃黏膜组织充血水肿,细胞形态较为均一,较少见杯状细胞及异型增生。见图1。

注:A 正常组;B 模型组;C iNOS抑制剂组;D 健脾清化化瘀汤低剂量组;E 健脾清化化瘀汤中剂量组;F 健脾清化化瘀汤高剂量组。

2.2 各组大鼠胃组织PTEN蛋白表达

免疫组化法检测大鼠胃组织PTEN蛋白表达及平均光密度值(累积光密度/面积,IOD/Area),结果显示,正常组的PTEN染色较深,表现为深棕色,蛋白表达水平明显较高;模型组PTEN染色浅,鲜少着色,PTEN蛋白较少表达;iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组PTEN染色介于正常组与模型组之间,阳性表达较正常组少(见图2)。运用Image-Pro Plus 6.0计算PTEN免疫组化的平均光密度值。结果显示,与正常组相比,模型组PTEN蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,iNOS抑制剂及中药的干预对PTEN蛋白表达有一定的逆转作用,健脾清化化瘀汤高剂量组PTEN蛋白表达上调(P<0.05),健脾清化化瘀汤中剂量组、iNOS抑制剂组PTEN蛋白表达显著上调(P<0.05;P<0.05),健脾清化化瘀汤低剂量组PTEN蛋白表达上调不明显,差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

注:A 正常组;B 模型组;C iNOS抑制剂组;D 健脾清化化瘀汤低剂量组;E 健脾清化化瘀汤中剂量组;F 健脾清化化瘀汤高剂量组。

表2 各组大鼠PTEN平均光密度值检测结果比较

2.3 各组大鼠miR-21 mRNA表达比较

RT-PCR结果显示,各组大鼠胃黏膜miR-21 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,模型组胃黏膜中miR-21 mRNA表达显著升高(P<0.05);与模型组相比,iNOS抑制剂及中药的干预对CAG伴Dys大鼠胃黏膜miR-21 mRNA的低表达有显著逆转趋势,健脾清化化瘀汤高剂量组miR-21 mRNA表达下调(P<0.05),iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤中剂量组miR-21 mRNA表达显著低于模型组(P<0.05;P<0.05),而健脾清化化瘀汤低剂量组miR-21 mRNA表达相对模型组差异没有统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3 各组大鼠胃黏膜miR-21 mRNA表达比较

2.4 各组大鼠PTEN mRNA表达比较

RT-PCR结果显示,各组大鼠胃黏膜组织PTEN mRNA的表达差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,模型组胃黏膜中PTEN mRNA表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,iNOS抑制剂及中药的干预对CAG伴Dys大鼠胃黏膜PTEN mRNA的低表达有逆转趋势,健脾清化化瘀汤高剂量组大鼠胃黏膜PTEN mRNA表达高于模型组(P<0.05),健脾清化化瘀汤中剂量组、iNOS抑制剂组大鼠胃黏膜PTEN mRNA表达显著高于模型组(P<0.05;P<0.05),健脾清化化瘀汤低剂量组大鼠胃黏膜PTEN基因表达与模型组差异没有统计学意义(P>0.05)。结果见表4。

表4 各组大鼠胃黏膜PTEN mRNA表达比较

3 讨论

CAG伴Dys临床症状主要表现为胃脘痞满、胃脘痛、呃逆嗳气、食欲不振等。中医对于CAG伴Dys尚无确切病名,根据临床症状大致可归属于“痞满”“胃脘痛”范畴。李乾构认为,本病病机以脾胃气虚为本,以痰、瘀、毒为标。而HP感染导致的CAG伴Dys又多兼夹湿热。故本病的治疗应以健脾益气、清热化湿、活血化瘀为主要治则[9]。健脾清化化瘀汤首以四君子汤健脾益气,充实脾土为先,使脾胃运化功能恢复正常。脾胃为气血生化之源,中气健旺,气血方能生化无穷。另取黄连、大黄及土茯苓清化湿热,陈皮、半夏曲燥湿化痰,消痞散结,莪术、三七、丹参活血化瘀、软坚散结,蒲公英、白花蛇舌草清热解毒化湿,能消除胃粘膜慢性炎症,蒲公英、白花舌蛇草、三七、土茯苓清瘀热,化湿毒,具有较强的抗HP作用。诸药配伍具有攻补兼施、扶正祛邪的作用。

课题组前期研究发现[10],健脾清化汤(组成包括党参、茯苓、白术、大黄、黄连、蒲公英、甘草、丹参)对HP相关胃炎SD大鼠具有一定的治疗作用,其机制可能与上调热激蛋白70的表达,进而抑制核因子-κB的表达以减轻炎症反应有关,另外,热激蛋白70可能通过抑制胃黏膜iNOS及一氧化氮产生,保护胃黏膜,减轻胃黏膜损伤。通过对耐药HP菌株的体外研究表明[11],健脾清化汤可抑制甲硝唑耐药幽门螺旋杆菌的生长。进一步运用RT-PCR检测发现,健脾清化汤可能通过抑制甲硝唑耐药HP菌株外排基因hefA、hefC的表达,从而发挥抗耐药HP的作用。健脾清化化瘀汤由健脾清化汤加减化裁而成,用于治疗CAG伴Dys具有一定的临床疗效,但其机制有待明确。

本实验通过MNNG联合HP感染、雷尼替丁、饥饱失常方法造模CAG伴Dys大鼠模型。选择氨基胍作为阳性对照药物,可抑制iNOS活性,进而降低胃黏膜一氧化氮含量,一方面可减轻炎症反应,一方面可减弱iNOS对miR-21表达的促进作用[12]。实验结果显示,给予干预治疗10周后,健脾清化化瘀汤高、中剂量组、iNOS组较模型组有不同程度改善,HE染色镜下可见腺体排列相对规则,腺体数目尚可,肠上皮化生及异型增生较少见,胃黏膜病变逐渐有好转趋势。健脾清化化瘀汤低剂量组胃黏膜好转不明显。说明健脾清化化瘀汤及iNOS抑制剂可改善CAG伴Dys大鼠胃黏膜情况,结合中药组各组大鼠胃黏膜变化情况,认为健脾清化化瘀汤中剂量组改善效果最明显。

研究表明,miR-21可通过调节多种靶基因调控PI3K/Akt信号通路,进而参与细胞增殖、侵袭、凋亡、坏死和血管生成[13]。PI3K产生的第二信使可参与细胞增殖、运动等多种细胞活动[14]。Akt作为PI3K的下游因子,也可参与调节细胞的生长、增殖、凋亡等细胞功能[15-16]。Wang等[17]发现,伊马替尼在治疗急性淋巴细胞白血病时产生耐药性的分子机制为miR-21的上调使PTEN基因表达下调,进一步阻断了PI3K/Akt信号通路,从而抑制了伊马替尼引起的细胞凋亡。当在Sup-b15细胞中联合使用伊马替尼及miR-21抑制剂时发现,PTEN表达的增加可阻断PI3K/Akt信号通路从而促进细胞凋亡。PDCD4在肿瘤中发挥抑癌基因的作用。Zhang等[18]的研究发现,在乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1中,上调miR-21的表达可减少PDCD4蛋白生成,并激活PI3K/Akt信号通路,从而抑制细胞的凋亡,提高细胞的增殖与侵袭。本项实验结果显示,在干预治疗后模型组miR-21表达最高,与正常组有显著差异,这与相关文献中论述的miR-21在胃癌组织及胃癌前病变胃组织的高表达相吻合。经过健脾清化化瘀汤治疗后,中、高剂量组大鼠胃组织miR-21表达比模型组降低(P<0.05),说明健脾清化化瘀汤可显著抑制miR-21的表达。与正常组相比,模型组PTEN mRNA及蛋白表达显著降低,说明在CAG伴Dys阶段PTEN表达出现下调。经过健脾清化化瘀汤治疗后,中药中、高剂量组大鼠胃组织PTEN在mRNA及蛋白层面表达量均明显升高。结合国内外文献报道,miR-21对抑癌基因PTEN的调控已受到广泛认可。由本实验结果可进一步推测,健脾清化化瘀汤可能通过下调miR-21表达,减轻对抑癌基因PTEN表达的抑制,使PTEN表达上调,并进一步激活PTEN下游信号通路,达到逆转胃癌前病变的作用。另外,中药中、高剂量组效果明显优于低剂量组,这一情况表明健脾清化化瘀汤对于CAG伴Dys的疗效与药物浓度存在一定关系。

考虑胃癌前病变的形成是多因素、多阶段参与的过程,且单因素造模周期较长、造模成功率低,本实验运用以MNNG为主的综合多因素造模的方法进行CAG伴Dys大鼠造模。MNNG是一种化学致癌剂,是目前建立CAG、CAG伴胃黏膜肠化生、CAG伴Dys及胃癌大鼠模型的公认用药。MNNG可直接作用于胃黏膜使细胞DNA改变从而发生癌变。而对于MNNG使用剂量的掌握,国内外文献尚无公认定论。本实验选用150 μg/mL MNNG溶液灌胃配合100 μg/mL MNNG溶液自由饮用进行造模,并由HE染色确认经造模大鼠胃黏膜上皮病变与胃癌前病变一致,最终成功建立胃癌前病变大鼠模型。但实验期间大鼠死亡率较高,考虑可能由于大剂量MNNG导致消化道损伤,进而引起大鼠胃肠道胀气,影响饮食饮水,造成大鼠死亡。此外,饥饱失常法与MNNG法联合,大鼠空腹饮用MNNG,增加了对肠道黏膜的刺激,引起肠道肿瘤的形成,也可能是大鼠死亡率高的原因之一。如何建立造模周期短、模型稳定的胃癌前病变大鼠模型尚需进一步探索。

综上所述,健脾清化化瘀汤可能通过直接或间接下调胃黏膜miR-21的表达,解除miR-21对抑癌基因PTEN表达的抑制,提高PTEN的表达,进一步调控PTEN下游信号通路,从而达到控制胃癌前病变向胃癌进展的作用。本实验从健脾清化化瘀立论,并将miR-21与胃癌前病变相联系,为中医药治疗Hp感染相关CAG黏膜异型增生提供新的方法和途径,也为健脾清化化瘀汤安全可靠地用于临床提供实验依据。本次实验未进一步探究PTEN下游信号通路,猜测其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路的激活有关,这一方面仍需进一步深入探究。