基于NLRP3炎症小体介导的中药抗纤维化药理机制近五年研究进展

梁甜 周晓玲 周琳

纤维化是一种持续免疫因素刺激作用下形成的慢性病理结果,表现为器官组织炎症、实质细胞损害、成纤维细胞效应细胞激活细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)过量形成,造成组织内纤维结缔组织增多[1]。一项研究显示,器官的纤维化占全世界全因死亡率的45%[2],纤维化是慢性炎症疾病进展的特征,在持续炎症刺激下影响任何组织器官发生纤维化病变,包括特发性肺纤维化、心肌纤维化和系统性硬化症等疾病通常被认为是逐渐进展且不可逆的。然而,目前多项临床前模型和临床试验表明,纤维化是一个高度动态的过程,具有固有可塑性[3]。并且,近年来越来越多的研究表明,中药及其有效成分可通过干预NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)相关通路来减轻、甚至逆转纤维化进展,因此本文基于探究中药抗纤维化药理机制,阐释中医药调节NLRP3炎症小体相关靶点、信号通路而发挥抗纤维化作用。

1 NLRP3炎症小体与纤维化的发生发展密切相关

1.1 NLRP3炎症小体的结构与功能

NLRP3炎性小体由一个可溶模式识别受体(pattern recognition receptors,PPPs)通过氨基端吡啉结构域(pyrin domain containing, PYD)与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的N 端与 NLRP3 连接,ASC的C 端与 procaspase-1 结合,三者共同组成NLRP3炎症体[4]。NLRP3炎性小体作为机体固有免疫系统的第一道保护屏障,它的激活将介导免疫级联反应以抵抗外来病原体的入侵和通过释放大量炎症介质促进机体损伤修复。NLRP3 通过pyrin结构域上的细胞质或质膜上的独特模式识别受体(PRRs),感知病原体衍生的病原体相关分子模式(pathogen associated molecule patterns,PAMPs)或宿主衍生分子的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),从而识别感染并监测非自身分子,参与各种炎性疾病的发病机。NLRP3炎性小体的异常激活上调促炎细胞因子,白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-18水平上调,促进免疫细胞渗透到感染或受损组织[4-5],介导适应性免疫进一步扩大炎症反应。因此,NLRP3炎症小体在激活机制炎症、代谢性和免疫系统等疾病方面起着重要作用。

1.2 NLRP3炎症小体参与纤维化的作用机制

纤维化疾病是由于严重的组织损伤或伤口愈合障碍引起的纤维结缔组织增多,在长期慢性炎症刺激和成纤维效应细胞过度激活的协同状态下导致的大量ECM增多的结果。早期研究发现 NLRP3炎症体主要存在免疫细胞,但近期越来越多的实验结果证明炎症小体也可以存在非免疫细胞中,如肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)、成纤维细胞/肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF)、内皮细胞(endothelial cells,ECs)和实质细胞(parenchyma cell,PCs)等[6]。在外源性因素损伤器官后,介导toll样受体(Toll-like receptor ,TLR)磷酸化,启动核因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路,各细胞内NLRP3的表达增加,上调IL-1β、IL-18前体的表达。内源性损伤相关分子模式的胞内损伤信号释放激活NLRP3,与适配器蛋白ASC和pro-caspase-1的多蛋白复合体组装,最终导致IL-1β和IL-18的成熟,引发炎症反应和gasdermin D的裂解,从而诱导焦亡[7-8]。目前较为普遍认可的理论主要有细胞外三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate,ATP)通过受体导致细胞钾离子外流诱导NLRP3的活化,ROS依赖的方式活化和溶酶体组织蛋白酶B活化炎症小体。基于这些证据,抑制NLRP3炎症小体通路的激活及调控炎症反应的研究为纤维化疾病的诊治提供了新的机会。

2 中药通过调节NLRP3相关P2X7嘌呤能受体靶点,减轻免疫炎症反应

2.1 治疗心肌纤维化(myocardial fibrosis,MFS)

MFS是由心肌重构引起的一种病理状态,其特征为ECM沉积,伴有收缩和舒张功能障碍,导致心肌细胞凋亡,损伤细胞的ATP泄漏激活细胞膜上的P2X7R,导致NLRP3炎症小体的活化,引起炎症反应,诱导心律失常和心力衰竭,加重心功能障碍和纤维化[9]。

中药复方参芪颗粒是在真武汤和四妙勇安汤的基础上研制而成,由黄芪、丹参、忍冬、玄参、乌头和甘草六味中药组成。经研究显示,参芪颗粒调节心肌巨噬细胞的炎症表型,通过抑制P2X7R-NEK7-NLRP3通路,干预急性心肌缺血(acute myocardial infarction,AMI)后巨噬细胞NLRP3炎症小体激活诱导的炎症反应,降低AMI后炎症损伤引起的心肌缺血—缺氧损伤和各种内源性损伤相关分子模式的释放,从而改善心功能和降低心肌纤维化风险[10]。扎冲十三味丸(ZC-13)是蒙医临床常用传统方剂,具有镇痛抗炎作用,姚坤辰[11]采用异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化模型和体外采用转化生长因子-β刺激活化人脐静脉内皮细胞诱导纤维化,发现ZC-13显著降低心肌组织中caspase-1、IL-1β、IL-1受体基因和IL-6等炎症因子的表达,并显著降低P2X7r及NLRP3的蛋白及mRNA表达。Kong等[12]用姜黄素预处理人单核细胞向巨噬细胞分化的实验中,发现姜黄素能下调P2X7R表达,并且调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,减轻巨噬细胞NLRP3、caspase-1的表达和IL-1β分泌,减轻炎症反应抑制动脉粥样硬化的进展,表明抑制心肌纤维化可以通过P2X7R-NEK7-NLRP3炎性体通路起作用,P2X7R有望成为心肌纤维化防治的新靶点。

2.2 治疗肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)

HF是机体对慢性肝炎造成的持续性肝细胞损伤的一种反应,在小鼠饮食和化学诱导的肝损伤模型中,发现坏死、凋亡的肝细胞会释放ATP等细胞内容物激活 ATP 门控阳离子通道受体P2X7R ,触发了细胞质离子转运(Na+和Ca2+内流,K+外排)进而激活NLRP3炎症小体,促使肝星状细胞活化,产生大量的基质沉积[13]。

宋健[14]研究发现,人参皂苷可以通过调控配体ATP 激活P2X7r门控离子通道,抑制K+外流以及Ca2+、Na+内流,从而抑制NLRP3和炎症因子表达,促使肝脏I型胶原和α-SMA产生减少,改善了硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)诱导的肝纤维化。体外研究发现,龙胆苦苷通过抑制P2X7受体-NLRP3的激活,并抑制脂多糖(LPS)和ATP刺激的RAW 264.7巨噬细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞的IL-1β的产生和 ECM 的沉积[15]。邓英等[16]在LPS和ATP联合诱导肝细胞(L02细胞)炎症发生的模型中,用连翘脂素干预可以抑制P2X7R的表达,减少ROS的产生从而抑制 NLRP3 炎症小体及其下游炎症因子IL-18 和 IL-1β的表达,从而缓解肝细胞炎症,同时连翘脂素还可以通过抑制 P2X7R 的表达而抑制 NF-κB 的转录及表达。另一项体内外实验发现,和厚朴酚能通过抑制P2X7r、NLRP3、IL-1β等多种炎症细胞因子的表达,有效抑制HSCs的活化,降低肝纤维化标志物α-SMA、I型胶原蛋白(Collagen I,Col I) 及mRNA的表达[17]。另外,木犀草素通过P2x7R-TLR4-RAGE-NLRP3轴来调节高迁移率族蛋白B1的释放,减少LPS/ATP引起的肝脏炎症[18]。中药单体二氢槲皮素、桦木素可通过阻断P2X7R介导的 NLRP3 炎症小体信号通路改善小鼠肝脏脂质堆积和脂肪变性,进而抑制脂肪性肝炎向纤维化进展[19-20]。提示中药提取物或单体可通过P2RX7抑制肝脏不同细胞中NLRP3的激活产生的炎症反应,起到肝纤维化的抑制作用。

2.3 治疗肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)

RIF几乎是所有慢性肾病进展到终末期的共同转归。研究发现,P2X7Rs的激活可能参与肾脏疾病,广泛存在于肾间室,在免疫细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞中表达,在炎症中上调,并通过P2X7R-ATP-NLRP3轴促进促炎介质的产生[21]。

研究发现,在顺铂诱导的慢性炎症和进行性肾纤维化模型中,给予黄连素(200 mg/kg)干预后下调了P2X7R表达进而抑制SIRT2/mdm2触发的肾纤维化[22]。在高脂饲粮加低剂量链脲佐菌素致大鼠DN模型和高糖刺激致小鼠足细胞损伤模型中,发现冬虫夏草能显著抑制足细胞中P2X7R的高表达和NLRP3炎性小体的激活及其下游效应因子IL-1β和IL-18的激活和释放[23]。钱盈盈[24]通过降低细胞外ATP水平和基因敲除P2X7R,抑制肾小管上皮细胞NLRP3炎症体活化改善肾脏缺血再灌注损伤,并降低肾脏炎症,表明中药可以尝试通过抑制P2X7R进而阻断ATP释放ATP受体信号通路的手段来减轻无菌性炎症造成的肾损伤过程。

3 中药通过抑制NLRP3相关活性氧自由基生成,减轻氧化应激

3.1 治疗心肌纤维化(myocardial fibrosis,MFS)

早期缺血性心肌细胞坏死时可释放大量ROS,引起氧化应激反应在心肌纤维化形成中起关键作用,ROS一方面可直接损害心肌功能,另一方面诱导NLRP3炎症信号的激活,诱导活性促炎细胞因子IL-1β和IL-18的产生,促进心肌纤维化,加重心肌梗死,降低心肌收缩功能[25]。

在结扎左前降支冠状动脉诱发心肌梗死的小鼠模型中,发现中药提取物黄芪甲苷干预后可以减少心肌线粒体中ROS的释放,并降低NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的表达,表明黄芪甲苷可以下调ROS/Caspase-1/GSDMD信号通路来缓解心肌梗死引起的心肌纤维化和心脏重塑[26]。在体内研究发现,人参皂苷Rb1通过对线粒体I依赖酵母NADH脱氢酶呼吸和再灌注诱导产生的ROS起抑制作用,可减少线粒体ROS生成,减小心肌梗死面积,限制心肌纤维化[27]。Li等[28]在高糖诱导的小鼠糖尿病心肌病模型中,口服四氢姜黄素 [120 mg/(kg·d)]12周可显著改善心功能,改善心肌纤维化和心肌肥厚,同时减少ROS的产生。另外,桑叶黄酮可显著升高糖尿病小鼠心肌线粒体总钙和 ATP 含量,增强线粒体功能,改善小鼠糖尿病心肌病心肌纤维化[29]。有研究表明,从忍冬科、车前科、杜仲科植物中提取的一种重要的生物活性物质桃叶珊瑚苷,可通过抑制 ROS生成,进而有效地抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖和 ECM 的生成[30]。知母的活性成分芒果苷具有抗氧化作用,在心肌纤维细胞中芒果苷通过激活核因子E2相关因子2(Nrf2),上调细胞内谷胱甘肽的含量,并驱动选择性自噬发生使 ROS水平降低,抑制心肌纤维化[31]。李梦[32]进一步在细胞水平模拟 MF损伤模型,发现益母草碱通过降低ROS水平和心肌组织中TGF-β含量,显著改善MF大鼠心肌组织纤维化程度,逆转MF。这些研究结果表明,ROS被认为是NLRP3炎症小体激活的关键调节因子,抑制ROS可以逆转NLRP3炎症小体的激活。

3.2 治疗肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)

在肺纤维化过程中,成纤维细胞增强了线粒体功能障碍,并产生了大量的线粒体ROS(mtROS),不仅引起线粒体脱氧核糖核酸(mitochondrial deoxyribonucleic acid,mtDNA)损伤、通透性转换孔开放及膜通透性改变导致细胞凋亡,而且mtROS作为是肺纤维化NLRP3炎性小体激活的关键,NLRP3过度激活诱导炎症反应促进肺纤维化发生[33]。

博来霉素气道滴入建立肺纤维化大鼠模型是典型的肺纤维化模型,研究发现,模型组和对照组的羟脯氨酸升高、丙二醛和ROS含量增加、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量减少,黄芪甲苷干预后可以减少肺组织羟脯氨酸含量,提高SOD含量,抑制肺损伤释放的大量ROS,起到抗纤维化和减轻胶原纤维沉积作用[34]。同样,在另一项体内研究表明,从中药南五味子提取出来的安五脂素单体能减少ROS 的产生,逆转氧化应激对肺组织造成的损伤,减轻肺组织纤维化[35]。张秉芬等[36]采用气管插管注入博来霉素法(5 mg/kg)建立大鼠肺纤维化模型,经过延龄草皂苷治疗后,大鼠肺组织 SOD 活性提高,ROS水平降低,肺纤维化标志蛋白fibronectin、Collagen I和 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和炎症因子表达减少,提示延龄草皂苷可能通过降低炎症和氧化应激水平来抑制肺纤维化发生。丹参酮 II A具有恢复氧化还原稳态的能力,冯菲菲[37]采用 DCFH-DA 检测矽肺大鼠肺组织ROS,显示丹参酮II A+矽肺组共处理后ROS绿色荧光强度较矽肺组显著下降,从而抑制氧化应激,减轻矽肺肺纤维化。温肺化纤汤是由生麻黄、熟地、鹿角霜、肉桂、炮姜、白芥子等12味中药组成,经研究证实,温肺化纤汤干预原代肺间充质干细胞(LMSCs)氧化应激损伤模型,可减轻过氧化氢诱导的LMSCs线粒体功能障碍和代谢失衡,下调ROS表达(P<0.05),通过增强线粒体最低限度的氧消耗速率和 ATP 水平,减轻氧化应激损伤[38]。因此,中药复方或中药提取物可以通过抑制肺组织ROS的产生,减轻氧化应激和炎症反应抑制肺纤维化。

3.3 治疗肾纤维化(pulmonary fibrosis,PF)

在代谢异常的疾病状态下,如高血糖、胰岛素抵抗、游离脂肪酸水平升高导致细胞内线粒体ROS累积,介导细胞内氧化应激并且激活NLRP3释放促炎因子,介导糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)、肾小管间质炎症和纤维化[39]。

体外研究显示,青蒿琥酯能调节线粒体ROS过量产生的线粒体功能和氧化还原失衡,并抑制了高糖诱导的炎性细胞因子的产生和ECM的沉积,改善糖尿病肾病小鼠肾脏的损伤[40]。大黄泄浊方在临床中治疗慢性肾功能衰竭(CRF)的常用方子,由大黄、黄芪、丹参、当归、地龙、水牛角、醋龟甲、土茯苓、积雪草9味中药组成。研究证明,大黄泄浊方对 5/6 肾切除大鼠造成的肾间质纤维化模型中,通过调控 ROS/TXNIP/NLRP3 通路,下调了硫氧还蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白、NLRP3、ASC、转化生长因子-β、IV型胶原、α-SMA和调纤连蛋白(FN)表达,保护慢性肾衰竭大鼠肾功能、延缓肾间质纤维化[41]。山茱萸具有抗氧化和抗炎和非特异性免疫增强作用,在治疗肝肾疾病有着特殊的功效,体内研究实验显示,山茱萸提取物治疗CRF后肾小球和肾小管萎缩、炎性细胞浸润和间质纤维化等病变程度较模型组减轻,ROS含量降低(P<0.05)[42];沈晓燕[43]用Western Blot检测人参皂苷Rg1干预后小鼠肾脏衰老相关性肾纤维化模型组织,结果表明Rg1可通过抑制NADPH氧化酶4(NOX4)介导的ROS氧化应激和NLRP3炎症小体激活来延缓肾脏衰老,减轻与衰老相关的肾损伤和纤维化。这些研究结果提示调控 ROS 相关NLRP3炎症小体通路可能是延缓氧化应激相关性肾纤维化进展的重要途径。

4 中药通过抑制NLRP3相关内质网应激通路,减少炎症因子和细胞死亡

4.1 治疗特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)

内质网应激(ERS)广泛存在于呼吸系统疾病发生过程中,在基因突变和环境暴露的条件下II 型肺泡上皮细胞(AEC II)发生功能障碍,导致内质网中错误折叠蛋白(UPR)的积累,发生ERS。ERS激活UPR后可通过肌醇依赖性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)和蛋白激酶R样内质网酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)促进TXNIP转录,诱导ROS产生或IL-1β mRNA转录,激活NLRP3炎性小体产生IL-1β,并介导内质网应激介导的β细胞死亡[44]。

在IPF小鼠模型,中药提取物黄芩素、岩白菜素均能抑制博来霉素(blm)诱导的上皮—间充质转化(EMT)过程,抑制NF-κB通路调控炎症反应,导致肺组织NLRP3、p 65、IκBα 蛋白表达减少,抑制IL-1β和IL-18的产生[45-46],因此推测可通过抑制NF-κB/ NLRP3/IL-1β 信号通路和调节代谢发挥治疗小鼠IPF的作用。另有研究发现,温肺化纤颗粒能通过下调blm构建肺纤维化模型小鼠的内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和促细胞凋亡蛋白 Bax 蛋白的表达,抑制 ERS 介导的凋亡发生,降低肺组织TGF-β1及 α-SMA mRNA和蛋白表达而达到改善肺纤维化的目的[47]。进一步体外研究显示,由经典方金水六君煎为基础,化裁而成补肾益肺消癥方,可以调控 AECⅡ细胞 ERS,下调分子 C/EBP- 同源蛋白(C/EBPhomologous protein,CHOP)凋亡通路中关键信号分子 CHOP、PERK 等蛋白及基因水平的表达,恢复细胞内环境的稳态、降低基底膜沉积,减轻肺纤维化[48]。王志超[49]则经体内体外研究证实,中药陈皮碱性提取物可以缓解AECⅡ的ERS,并通过减少AEC II中TGF-β1等细胞因子的分泌间接降低肺成纤维细胞的胶原表达,最终缓解肺纤维化。此外,Shen等[50]建立IPF动物模型体和体内肺纤维化模型中,进一步证实,麦门冬汤可以降低AECIIs中,内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白 78(glucose regulated protein 78,GRP78)和CHOP的表达,并增加AECIIs表面活性蛋白C (SPC)的分泌,显著减轻了肺组织纤维化区的凋亡,提示IPF的发生机制可能与ERS 的下游CHOP、PERK-NLRP3通路参与的炎症因子密切相关,这可能为肺纤维化的治疗提供一种新的方法。

4.2 治疗胰腺炎纤维化(pancreatitis fibrosis,PF)

PF是各种原因所致慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的共同特征,以腺泡细胞破坏、萎缩和进行性纤维化为主要疾病特点一组多因素炎症综合征,NLRP3炎症小体的激活是CP中多种慢性炎症反应和包括胰腺纤维化在内的慢性纤维化的中心介导物[51]。

高丽娟等[52]用L-精氨酸建立CP胰腺纤维化动物模型,凭借免疫组化技术及 Western-blot 检测 CP 胰腺纤维化内质网应激凋亡途径的相关调控CHOP和GRP78的变化情况,发现模型组CHOP及GRP78蛋白表达显著上升,经予胰泰复方治疗后,胰高组、胰中组、对照组CHOP及GRP78蛋白表达显著减少,与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。有研究表明,大黄丹参可以降低高脂饮食诱发的胰腺纤维化大鼠ERS相关JNK(the c-Jun N-terminal kinases)、GRP和Caspase-12 mRNA蛋白表达,下调内质网应激介导的过度凋亡发挥防治胰腺炎纤维化的作用[53]。另外,通过体外培养大鼠胰腺腺泡细胞系AR42J细胞,结果证明苍术的药物浓度超过1 mg/mL,细胞活力下降,证明苍术能通过抑制腺泡细胞内质网应激引起的细胞内GRP78高表达,降低细胞上清液中肿瘤坏死因子TNF-α (tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素的含量,从而抑制NF-κB核转移来缓解急性胰腺炎的病理改变[54]。在大鼠胰腺星状细胞纤维化的模型中,用氧化苦参碱干预后能抑制NLRP3炎性小体活化,下调α-SMA、FN、Co L-I、NLRP3、caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表达而产生抗纤维化作用[55]。ERS发生时CHOP 和GRP78表达升高,并且伴随炎症因子大量分泌,因此推测ERS可能参与了NLRP3炎症小体介导的炎症反应促进PF发展,但具体调控机制有待更多相关实验证实。

5 中药通过抑制NLRP3相关自噬通路,减轻炎症反应及调控细胞凋亡

5.1 治疗肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)

自噬是机体的一种自食机制,可以吞噬细胞器或大分子蛋白质,降解损坏、衰老的细胞以维持内环境稳态,自噬在肺纤维化中起着双重作用[56]。

一方面,自噬通量的过度激活,诱导肺泡巨噬细胞凋亡(AM),凋亡的AM会再分泌大量炎症因子,引起炎症级联反应,增强肺成纤维细胞的增殖和迁移,在矽肺肺纤维化的发展中起至关重要的作用。中草药冬凌草的提取物冬凌草甲素具有抗炎、抗菌作用,研究表明,对矽尘所致的肺泡巨噬细胞损伤和炎性活化具有调节作用,高竞妍建立矽肺模型,予冬凌草甲素按10 mg/kg 剂量给药,结果发现冬凌草甲素在体内抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达和酶活性,并与矽肺模型组相比降低转录激活因子1(STAT1)和NF-κB p65表达,延缓矽肺小鼠肺炎和肺纤维化的发生发展[57]。Tan等[58]采集小鼠肺泡巨噬细胞,分为对照组、苍术内酯-1(ATL-Ⅰ)组(100 μmol/L)和二甲基亚砜(DMSO)组(100 μmol/L),研究结果显示ATL-I组肺泡巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著降低,且肺泡巨噬细胞中p-NF-κb表达水平、微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)/LC3-I比值也显著降低,表明ATL-I是通过抑制肺泡巨噬细胞自噬活性,减少肺泡巨噬细胞炎性因子的释放减矽肺纤维化。有研究显示,大黄素能够通过下调促凋亡蛋白-BCL2关联X蛋白(BCL2 associated X protein,Bax)和促炎因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β的表达,以及上调抗凋亡蛋白 BCL2 来抑制硅诱导过度自噬,抑制肺泡细胞凋亡、减轻炎症反应发挥抗纤维化作用[59]。

另一方面,自噬功能发生障碍,自噬通量减少,可通过刺激细胞进行线粒体介导的 NLRP3 炎症小体激活,使IL-1β和IL-18过度分泌,导致焦亡发生,并进一步加速肺纤维化的形成[60]。尚璐璐等[61]用5 ng/mL TGF-β1诱导A549 细胞48小时建立肺纤维化细胞模型,予柴胡皂甙d干预后可提高肺纤维化的自噬流受体,升高E- 钙黏蛋白、Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平,下调Col-I、α-SMA、p62等自噬通量蛋白表达水平,减轻肺纤维化程度。杜思曈[62]建立实验性矽肺小鼠模型,在实验组小鼠肺组织中发现LC3II、自噬相关基因5(autophagy-related gene 5, ATG5)、BECN1和P62蛋白水平增高,同时建立小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)体外矽尘暴露模型,给予自噬激活剂结果提示自噬通量的减少可以增加矽尘所致的小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)的凋亡,予薯蓣皂苷干预后,通过激光共聚焦显微镜观察到薯蓣皂苷可以促进MH-S细胞内的自噬流,其机制是促进肺泡巨噬细胞的线粒体自噬,缓解矽尘诱导的线粒体ROS高表达,促进MH-S细胞自噬相关蛋白LC3II、BECN1的表达,减少P62蛋白的表达,并且降低矽尘诱导的肺泡巨噬细胞凋亡发挥抗纤维化作用。上述研究结果提示适度自噬在肺纤维化中具有保护作用。

5.2 治疗肾纤维化(pulmonary fibrosis,PF)

自噬被认为在纤维化相关的多种慢性肾脏病(CKD)中起关键作用。研究证实,自噬可调节肾纤维化,Sun A N等[63]在单侧输尿管梗阻(UUO)致肾小管间质纤维化(TIF)中,敲除肾小管远端TECs中特异性的自噬基因Atg7,发现LC3-II/LC3-I明显减少,自噬明显受到抑制,进一步研究发现,肾远端TECs特异性Atg7基因缺失后,可通过氧化DNA损伤促进受损线粒体的积累,ROS生产增多,激活NLRP3炎性小体。

升清降浊胶囊是在参芪地黄汤的基础上配以小柴胡汤合升降散,具有益气升清、利湿泄浊、活血化瘀之效,是临床上防治慢性肾脏病的常用方,童楠等[64]以10 ng/mL的TGF-β1为造模条件,制备不同浓度的含药血清对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞进行干预,当予以药物干预后,升清降浊胶囊组α-SMA及 Collagen Ⅳ表达较对照组减少,MDC 绿色荧光较强,Beclin-1、LC3-II/I表达增加,提示升清降浊胶囊含药血清可减轻TGF-β1干预下系膜细胞纤维化的形成,可能与其恢复自噬活性相关。姜黄素是一种非甾体类抗炎天然药物,葛亮等[65]建立糖尿病肾病大鼠模型,予姜黄素干预后,通过促进自噬相关蛋白 LC3 表达水平增加,并阻止了 ECM 沉积改善糖尿病肾病的肾脏纤维化。黄芪皂苷A (CA)是黄芪的一种活性成分,Ren等[66]通过体内实验研究,发现CA可减轻糖尿病小鼠肾小球肥大、胶原基质沉积和肾小管间质纤维化,进一步进行体外研究,发现CA可以通过提高自噬升高LC3II/LC3I和Beclin1水平,并且在HK-2细胞中特异性过表达的NOX4,消除了TGF-β1诱导的细胞上皮-间充质转化(EMT)、ROS生成和NLRP3蛋白表达,其机制可能通过靶向NOX4抑制改善NLRP3炎症小体和提高自噬激活发挥抗肾纤维化作用。表明增加自噬通量可以清除受损的线粒体抑制 ROS 的产生,从而抑制 NLRP3 炎症小体的激活。另外有研究也发现,丹酚酸 B、大黄素、白藜芦醇能升高LC3-II及 Beclin-1蛋白表达,加强自噬的激活,改善肾间质纤维化而发挥保护肾脏的作用[67-69]。但是持续的自噬激活状态下,导致自噬溶酶体在细胞内大量聚集,不仅无法及时清除ECM,反而会导致细胞死亡促进疾病进展。

5.3 治疗肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)

在肝纤维化进展中,HSC的异常活化与增殖是纤维化进程的核心环节,自噬参与HSC激活机制的研究也越来越受到关注。Li等[70]研究表明,自噬可以激活HSC,增加ECM的释放,加剧纤维化的发展;除此之外,在自噬过程中,含有溶酶体的组织蛋白酶B (NLRP3炎症小体的激活剂)会被释放到细胞质中,从而导致NLRP3炎症小体的激活,并最终激活HSC。体外细胞实验发现,从中药黄连、黄柏中分离出来的小檗碱通过改变LX-2细胞中p62 和LC3表达,下调Atg5 mRNA 及蛋白水平来抑制HSC 活化,增殖以及迁移,从而达到抗肝纤维化的效果[71]。同样,有研究表明,人参皂苷Rg3、莪术醇、芍药苷均能通过抑制肝脏中自噬基因Atg5,诱导肝星状细胞自噬与坏死性凋亡,进而缓解肝损伤和肝纤维化[72-74];而柴胡皂素d通过增加p62表达和降低BECN1表达,抑制肝脏自噬的激活,显著减轻了ccl4诱导的肝纤维化[75]。另外也有研究证明,姜黄素通过调节AMPK/PI3K/AKT/mTOR信号通路提高肝细胞自噬水平[76],双氢青蒿素通过降低自噬底物p62,促进自噬治疗肝纤维化[77],大蒜素能够通过上调的Atg7水平,增强自噬流改善小鼠纤维化及肝损伤[78]。

6 中药通过靶向NLRP3相关微小RNA,减轻炎症损伤及抑制纤维化

微小RNA(MicroRNAs,miRNA)主要通过靶向mRNA影响基因表达水平,在调控包括炎症在内的多种细胞过程的基因表达中发挥重要作用。研究表明,miR-145被认为是某些纤维化疾病的调控因子,miR-22-3p、miR-21、miR-132、miR-181a等[79]微小MRA可靶向和调节巨噬细胞中的NLRP3,引起组织、细胞炎症反应。虎杖苷、山梨醇等中药提取物能增强miR-200a,Keap1下调,Nrf2抗氧化途径失活,ROS驱动TXNIP表达降低,NLRP3炎症小体受到抑制,从而减轻肝脏炎症和脂质沉积[80]。白芍总苷[81]可以通过调控 MALAT1/miR-876-5p/NLRP3 轴来抑制肝纤维化的发生。莪术醇可通过调控miR-125b/NLRP3信号通路的活动达到抗肝纤维化作用[82]。肉桂提取物可通靶向miR-21、miR-155的表达抑制NLRP3 炎症小体活化,进而抑制肝纤维[83]。

在其他脏器纤维化方面,多项研究显示,相同的中药其有效成分能够通过不同的靶点、信号对各脏器纤维化NLRP3通路起到一定程度的抑制作用,如人参皂苷既能通过抑制P2X7嘌呤能受体抑制钾离子外流,又能改善线粒体功能障碍减少ROS产生,起到了改善肝纤维化和心肌纤维化的作用;莪术醇既能通过抑制肝脏中自噬通量,又能通过调控HSC中微小RNA,起到抑制NLRP3通路作用,减轻炎症反应起到抑制肝纤维化作用。又如,白藜芦醇既能通过调节自噬水平也能靶向微小RNA,在心脏和血管保护,肾脏炎症损伤等方面起到保护作用,在高糖诱导的成骨细胞凋亡模型中,白藜芦醇可靶向调控miR-25抑制NF-κB信号通路,降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表达,起到发挥抗炎、抗纤维化作用[84]。黄芪甲苷具有抗氧化酶活性,在肺损伤和心肌损伤时释放的大量ROS起到抑制作用[85],也有研究发现,黄芪甲苷在糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化模型中降低了血清 NLRP3、Caspase-1及TGF-β蛋白表达水平,但通过调节或抑制NLRP3相关氧化应激通路、离子信号通路还是自噬通路,具体中药调控机制还未见报道。

7 结语与展望

综上所述,NLRP3的活化在多种器官及组织纤维化的发生发展过程中发挥着重要的作用,本文综述已发现的多种中药的有效成分和中药复合制剂可以通过干预NLRP3通路上游信号相关靶点,起到抑制炎症反应、减轻氧化应激和调控细胞凋亡及增殖等,从而抑制纤维化进展,但由于NLRP3的相关信号通路比较多,各器官纤维化发病机制因细胞类型、起效靶细胞和炎性小体启动下游信号分子的不同,使中医药在调控NLRP3相关纤维化疾病多从药效加以验证,对其具体的调控机制研究不够深入,进一步剖析膜受体通路之间的相互关系及药物干预靶点,阐释其机制作用,为中药提取物应用于临床治疗纤维化的提供重要研究方向。