两株秦岭野生黑木耳菌株分离鉴定及驯化试验

曹建刚 李存玲 刘 阳 毛仪楠 陈再民 陈鹏博

（陕西省商洛市农业科学研究所，陕西 商洛 726000）

黑木耳又称木耳、光木耳、云耳、树耳、木娥等，为担子菌门、木耳目、木耳科、木耳属真菌[1]。陕西省商洛市一直将食用菌产业列为脱贫攻坚、乡村振兴的重点特色产业，2022 年以来更是将食用菌产业列为“菌果药畜茶酒”六大特色产业之首，食用菌作为助推商洛市乡村振兴的“大产业”，发展黑木耳产业是重中之重。商洛市2020年袋栽木耳1.05亿袋，干品产量5 270 t，产值5.2 亿元；2021 年栽培木耳1.41亿袋，干品产量5 600 t，产值5.4亿元；2022年栽培木耳1.55 亿袋，干品产量7 600 t，产值7.3 亿元。商洛市现有规模化木耳生产基地87处，木耳生产大棚3600 个，年产1 000 万袋以上的菌包生产线7 条，木耳生产企业20 多家，合作社35 个，木耳产业从业人员5 000 多人。以柞水县、山阳县、商州县、镇安县为主，辐射全市的木耳产业布局已基本形成，商洛木耳产业得到高质量快速发展，“小木耳”切实做成“大产业”，为商洛市巩固脱贫攻坚成果与推动乡村振兴战略全面实施发挥重要作用。

商洛市要做大做强黑木耳产业，推动商洛市木耳产业高质量发展，加快黑木耳种质创新，做强农业“芯片”（黑木耳优良新品种选育）为首要任务。商洛市地处秦岭腹地，野生黑木耳种质资源丰富，采集驯化黑木耳野生菌株，既可以快速解决商洛市主栽黑木耳品种短缺、依赖外省品种的问题，也可以为黑木耳杂交育种提供有效的种质资源[2]。为此笔者对采自陕西省商洛市丹凤县、山阳县的两株秦岭野生黑木耳进行组织分离、分子生物学鉴定及栽培试验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株：丹凤野生黑木耳菌株，采自商洛市丹凤县峦庄镇老林沟林场（图1）；山阳野生黑木耳菌株，采自山阳县小河口镇小河口街村山坡；对照菌株为黑威15，商洛市主栽品种，商洛市农科所食用菌研究室保存。

图1 野生黑木耳（拍摄地丹凤县）生态照

（2）供试培养基：①综合马铃薯培养基（PDA）为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，自来水定容至1 000 mL。②原种（栽培种）培养料配方为木屑85%，麸皮12%，白糖1%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。③栽培袋培养料配方为木屑80%，麸皮15%，豆粕3%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。

1.2 试验方法

1.2.1 子实体形态观察

取完整子实体部分，观察并描述其表面性状、结构、颜色，并进行形态学特征初步鉴定[3]。

1.2.2 野生菌株的组织分离及菌种的制备

取干耳泡24 h，用75%酒精浸泡2～3 min，用无菌水反复清洗干净后，再用滤纸吸干表面水分，用剪刀将耳片剪成小耳片，用接种针挑取小耳片至PDA 平板，26 ℃培养，待分离组织长出菌丝后纯化1～2 次转入PDA 斜面培养基培养，即可获得母种。母种接种到原种培养基上发菌后至长满袋即可获得原种（栽培种）。

1.2.3 野生黑木耳菌株ITS全序列分析

将丹凤野生黑木耳菌株、山阳野生黑木耳菌株分别转管培养，挑选纯化、生长健壮的两株野生黑木耳菌株送往上海生工生物工程股份有限公司进行ITS全序列分析与分子生物学鉴定。

1.2.4 拮抗试验

将两株野生黑木耳菌株与对照菌株黑威15 两两拮抗培养试验（26 ℃下黑暗培养），观察拮抗反应。3次重复。

1.2.5 野生黑木耳菌株菌丝培养特性观察

1.2.5.1 PDA平板培养菌丝观察

将供试菌株分别接至PDA 平板（直径9 cm），26 ℃下黑暗培养，测定菌丝生长速度及记录长势。母种菌丝生长速度（cm/d）=菌丝培养皿内直线生长量（cm）/菌丝生长天数（d）。母种（栽培袋）菌丝生长速度采用Microsoft Excel 2021 进行数据处理，采用SAS 8.0进行方差分析和Duncan检测。

1.2.5.2 原种料袋菌丝生长观察

将供试菌株母种接种至原种料袋，26 ℃下黑暗培养，每个菌株各15袋。观察并记录菌丝长势及抗杂能力。

1.2.5.3 栽培料袋菌丝生长观察

将供试菌株原种接种至栽培料袋（塑料袋规格为16 cm×37 cm×0.0036 cm），26 ℃下黑暗培养，每个菌株各100袋。测定菌丝生长速度，记录长势、抗杂能力。栽培袋内菌丝生长速度（cm/d）=菌丝生长量（cm）/菌丝满袋用时（d）。

1.2.6 出耳试验

栽培袋菌丝满袋经过后熟，刺孔后移至大棚内地栽出耳。观察记录比较各菌株现芽情况、出耳表现，观察子实体外观、颜色，统计产量。

2 结果与分析

2.1 两株秦岭野生黑木耳菌株ITS全序列分析

采用试剂盒提取基因组DNA，扩增两株秦岭野生黑木耳菌株ITS 序列，可发现均有大小约600 bp的单一条带，测序结果两株秦岭野生黑木耳菌株的ITS 序列大小均为576 bp（图2）。通过BLAST 分析，丹凤野生黑木耳菌株（Genbank 登录号SUB13797248）与陕西理工大学Qian X T（2015）发现的黑木耳（KT964887.1）相似性达99.65%，为木耳属，黑木耳；山阳野生黑木耳菌株（Genbank 登录号SUB13797271）与西北农林科技大学Yu Z（2008）发现的黑木耳（EU520194.1）相似性达99.83%，为木耳属，黑木耳。

图2 两株野生菌株ITS-PCR琼脂糖电泳图

2.2 拮抗试验结果

由表1可知，丹凤野生黑木耳菌株、山阳野生黑木耳菌株与对照菌株黑威15均有明显的拮抗线，丹凤野生黑木耳菌株与山阳野生黑木耳菌株也有明显的拮抗线，三者之间互有拮抗反应（图3），说明他们亲缘较远。

表1 拮抗试验结果

图3 供试黑木耳菌株拮抗反应（左为平板正面，右为平板反面）

2.3 不同基质菌丝培养特性观察结果

由表2 可知，丹凤野生黑木耳菌株平板培养菌丝洁白、浓密、整齐，山阳野生黑木耳菌株菌丝洁白、绒毛状、整齐；菌丝生长速度，山阳野生黑木耳菌株与黑威15差异显著；丹凤野生黑木耳菌株与山阳野生黑木耳菌株、丹凤野生黑木耳菌株与黑威15母种菌丝生长速度之间的差异均不显著。

表2 供试黑木耳菌株平板培养菌丝生长特性

由表3 可知，原种料袋内供试黑木耳菌株菌丝颜色、长势差异不大，但丹凤野生黑木耳菌株抗杂能力强，山阳野生黑木耳菌株抗杂能力弱。

表3 供试黑木耳菌株原种培养结果

由表4可知，丹凤野生黑木耳菌株、黑威15抗杂能力强，山阳野生黑木耳菌株抗杂能力一般（同原种培养结果一致）；山阳野生黑木耳菌株菌丝生长速度显著快于丹凤野生黑木耳菌株及黑威15菌株。

表4 供试黑木耳菌株栽培料袋菌丝培养结果

2.4 出耳试验结果

2.4.1 供试黑木耳菌株催芽结果

供试黑木耳菌株栽培袋菌丝长满袋经过后熟，刺孔进棚开始集中催芽，催芽时保持温度15～25 ℃，空气相对湿度70%～90%，视天气情况通风，做到“保温保湿小通风”[4]。

由表5可知，山阳野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、早，整齐；丹凤野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、居中（较山阳野生黑木耳菌株晚3～5 d），较整齐；对照黑威15菌株耳基、耳芽形成慢、晚，较整齐。

表5 供试黑木耳菌株催芽情况

2.4.2 供试黑木耳菌株产量及子实体性状

由表6可知，丹凤野生黑木耳菌株单片、耳大耳薄，颜色黄、产量高，抗高温，少筋或无筋，早熟；山阳野生黑木耳菌株单片、耳中等薄，产量低，不耐大水、高温，无筋，早熟；黑威15菌株（对照）单片、个大肉厚，产量一般，大筋，中熟（图4、图5）。

表6 供试黑木耳菌株产量及子实体性状

图4 试验黑木耳菌株出耳状态[自左至右为山阳野生菌株、丹凤野生菌株、黑威15（CK）]

图5 人工栽培的丹凤野生黑木耳菌株子实体（左为耳片腹面，右为耳片背面）

山阳野生黑木耳菌株耳片腹面黑褐色，背面瓦灰色（图6），耳状，边缘不规则，无筋，单耳质量（干）0.61 g。

图6 人工栽培的山阳野生黑木耳菌株子实体（左为耳片腹面，右为耳片背面）

黑威15 菌株耳片腹面黑色，背面深瓦灰色（图7），耳状，边缘规则，大筋，单耳质量（干）1.01 g。

图7 黑威15菌株子实体（左为耳片腹面，右为耳片背面）

丹凤野生黑木耳菌株耐高温，抗逆性强；黑威15 抗逆性较强；山阳野生黑木耳菌株不耐高温，抗逆性弱。

3 小结与讨论

试验结果表明，采自秦岭的两株野生黑木耳菌株经分子生物学鉴定均为木耳属，黑木耳。袋料栽培结果，丹凤野生黑木耳菌株比对照黑威15 早熟、产量高、抗杂抗逆性强、耐高温，有望成为一株性状优良、适于生产应用的黑木耳菌株，缺点是颜色偏黄；山阳野生黑木耳菌株与对照黑威15 相比，虽产量低、抗杂抗逆性弱、不耐大水和高温，但其耳芽形成快、早、整齐，早熟，颜色黑，可以用作杂交选育优良菌株亲本。