灵芝菌丝水提物活性成分分析研究

孙国强 董金颖 曹发昊

（1 山西瑞芝生物科技有限公司，山西 运城 044000；2 运城学院，山西 运城 044000）

灵芝Ganoderma lucidum，自古就是名贵的药用真菌[1-2]，含有多糖类、三萜类、甾醇类、核苷类、氨基酸、多肽及多种微量元素，具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、保肝、提高机体耐缺氧能力等作用[3-8]。2000 年版《中国药典》规定，赤芝、紫芝子实体为药材来源[9]。市场上以灵芝子实体或孢子为原料的保健食品较多，但不管是野生还是人工栽培的灵芝都极易受自然条件限制，产品质量波动大，生产规模远不能满足市场需求[10］。近年来，采用发酵技术生产灵芝菌丝，实现了规模化量产，可有效解决以上问题[11]。研究表明，灵芝菌丝与子实体的营养成分十分相似，对人体同样有药用作用[12]。

国内外针对灵芝子实体及其孢子的成分、含量研究较多[2，3，6，9-10]，但对灵芝菌丝的相关研究报道却较少[5-11]，且目前尚无较全面的灵芝菌丝水提物活性成分分析数据，限制了灵芝菌丝水提物活性成分产品开发。因此，笔者较系统地分析研究灵芝菌丝水提物的多糖、三萜、甾醇、灵芝酸、腺苷、氨基酸、微量元素、农药残留及黄曲霉毒素的含量，以期为其作为食品新资源提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）灵芝菌丝水提物：灵芝菌丝水提物是由山西瑞芝生物科技有限公司的灵芝深层液态培养物经过滤，水洗得灵芝菌丝，再按料液比1∶8用水煎煮提取2次，混合提取液即得。

（2）主要仪器：UV2550 紫外-可见分光光度计（日本岛津株式会社），DK615HTD超声波清洗器（深圳市得康科技有限公司），Agilent1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），DHG9620A 电热鼓风恒温箱（深圳市爱特尔电子科技有限公司），BP211D电子天平（德国赛多利斯集团），AL204电子天平（梅特勒托利多科技中国有限公司），HHS4 数显恒温水浴锅（上海致金仪器设备有限公司），EXPEC510 减压平行浓缩仪（杭州谱育科技发展有限公司），GILSON GX274 全自动固相萃取仪（美国吉尔森公司），XT-9 900 A 微波消解仪（上海新拓分析仪器科技有限公司），AA220 原子吸收分光光度计（美国瓦里安公司），300MS 气质联用仪（美国瓦里安公司），UPLC-TQD液质联用仪（美国沃特斯公司）。

（3）主要试剂：无水葡萄糖、齐墩果酸、灵芝酸A、D、F、G 和腺苷（均购自中国食品药品检定研究院）；硫酸、蒽酮、乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙腈、甲酸、盐酸、硝酸、苯酚、无水乙醇、浓硫酸、二水合磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠（均购自国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖、三萜及甾醇测定

多糖测定采用蒽酮-硫酸法，三萜及甾醇测定采用香草醛-高氯酸法，方法依据参考文献[13]。

1.2.2 灵芝酸及腺苷测定

按文献[14]方法分析灵芝酸、腺苷。

试样制备：将灵芝菌丝水提物浓缩干制后，精密称取粉末1.025 4 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL 溶解，超声处理40 min，摇匀抽滤，收集滤液，药渣再次加10 mL 甲醇，超声处理40 min，抽滤。收集合并两次滤液，旋干，用色谱级甲醇定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A、D、F、G和腺苷各 1.10 mg、1.06 mg、0.95 mg、1.11 mg、1.03 mg 于一离心管中，加入1 mL 色谱级甲醇，超声溶解，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。

测定条件：色谱柱为JADE-PAK®ODS-AQ（5 μm，250×4.6 mm），流动相为乙腈（A）：0.1%甲酸水（B）。

表1 梯度洗脱条件

1.2.3 氨基酸组成测定

按文献[15]方法分析氨基酸组成。

1.2.4 微量元素分析

按文献[16]第一法电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析微量元素。

样品处理方法：将灵芝菌丝水提物浓缩干制后，称取0.3 g 样品，于微波消解罐中，加入5 mL 纯硝酸，摇匀，放入微波消解仪中，按微波消解程序进行消解（表2）。消解完成后，将消解罐转移至电热板上赶酸，赶酸至近干，加水溶解并转移至25 mL容量瓶中，定容，摇匀。

表2 微波消解程序

1.2.5 农药残留及黄曲霉毒素测定

按文献[17]2341 农药残留量测定法项下第五法药材及饮片（植物类）中禁用农药残留测定法，2351真菌毒素测定法项下黄曲霉毒素测定法，分析33种禁用农药残留、黄曲霉毒素。

2 结果与分析

2.1 灵芝菌丝水提物多糖、三萜及甾醇含量

由表3可以看出，灵芝菌丝水提物与子实体、菌丝体一样含有多糖、三萜及甾醇，质量分数分别为0.43%、0.18%。

表3 灵芝菌丝水提物中多糖、三萜及甾醇含量

2.2 灵芝菌丝水提物灵芝酸及腺苷含量

由表4 可以看出，灵芝菌丝水提取中含有灵芝酸A、D、F、G 以及腺苷，质量分数分别为7.2 μg/g、6.9 μg/g、32.0 μg/g、12.6 μg/g、42.1 μg/g。

表4 灵芝菌丝水提物中灵芝酸及腺苷含量 单位：μg/g

2.3 灵芝菌丝水提物氨基酸及含量

由表5 可以看出，灵芝菌丝水提物中氨基酸种类丰富，含有除色氨酸外的7 种人体必需氨基酸在内的16种常见氨基酸，其中含量较多的氨基酸依次为谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸，质量分数分别为1.88 g/100 g、1.78 g/100 g、1.15 g/100 g，这些氨基酸为其主要氨基酸。灵芝菌丝水提物中氨基酸总量达13.70 g/100 g，必需氨基酸总量、支链氨基酸总量和芳香族氨基酸总量分别占氨基酸总量的31.02%、15.77%、8.25%。灵芝菌丝水提物中含有高量支链氨基酸和低量芳香族氨基酸，可利用这种特殊的氨基酸模式开发产品[18]。

表5 灵芝菌丝水提物中氨基酸及含量 单位：g/100 g

2.4 灵芝菌丝水提物微量元素含量

由表6 可以看出，灵芝菌丝水提物中含有钾、钙、镁、铁、锰、锌、铜等7 种人体必须微量元素在内的12种微量元素，其对细胞生长及机体的正常生长发育等起着重要作用。灵芝菌丝水提物具有高钾低钠的特点，其中钾的含量最多，质量分数高达2 342 mg/kg，还含有丰富的镁（541 mg/kg）和钙（193 mg/kg），以及0.15 mg/kg的硒。

表6 灵芝菌丝水提物中微量元素含量 单位：mg/kg

2.5 灵芝菌丝水提物农药残留及黄曲霉毒素分析结果

为了确保灵芝菌丝水提物的安全无毒，按照《中国药典》2020年版四部“0212药材和饮片检定通则”检测甲胺磷、久效磷、磷胺、苯线磷、地虫硫磷、六六六、滴滴涕、除草醚、杀虫脒等33种禁用农药残留及黄曲霉毒素，详见表7。

由表7 可以看出，灵芝菌丝水提物的33 种禁用农药残留和黄曲霉毒素均未检出，证实其安全无毒，具备开发成食品新资源的前提条件。

3 小结与讨论

灵芝子实体、孢子、菌丝体因含有多种类似的有效成分，如多糖、三萜、氨基酸和微量元素，已被应用于开发药品、保健食品、特医食品等[3-8]。当前灵芝正作为一种重要的药食同源物质按照国家卫生健康委、国家市场监管总局联合发布的《关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》在福建、广东、广西、江苏等十几个省开展试点工作。

研究结果表明，灵芝菌丝水提物未检测到33种禁用农药残留和黄曲霉毒素，含有0.43%多糖和0.18%三萜及甾醇；灵芝酸A、D、F、G 质量分数分别为7.2 μg/g、6.9 μg/g、32.0 μg/g、12.6 μg/g，腺苷质量分数为42.1 μg/g；含有7 种人体必需氨基酸在内的16 种常见氨基酸，质量分数较高的氨基酸依次为谷氨酸（1.88 g/100 g）、天冬氨酸（1.78 g/100 g）、精氨酸（1.15 g/100 g），氨基酸总量达13.7 g/100 g；含有7 种人体不可缺的微量元素在内的12种微量元素，其中钾的质量分数高达2 342 mg/kg，含有丰富的镁（541 mg/kg）和钙（193 mg/kg），还含有0.15 mg/kg 的硒。灵芝菌丝水提物含有的多种生物活性成分与子实体和菌丝保持一致，表明其能被用于药品、保健食品、食品等领域，还可作为一种天然营养补充剂。

研究较全面地分析灵芝菌丝水提物的活性成分，为其质量评价提供科学依据，为其进一步开发提供理论支撑，对推动灵芝产业的健康发展具有深远意义。