秦巴山区羊肚菌稳产菌株的选育

霍文严 乔 婷 贺雪莲 戴 璐 刘 愚 祁 鹏 张黎光 路鹏鹏 江 鑫 李峻志

（陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043）

羊肚菌，隶属于子囊菌门，盘菌亚门，又名草笠竹，羊肚菜，因其菌盖表面凹凸不平，形似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌的味道鲜美，香味独特，营养丰富，保健功效齐全，是一种享誉世界的高档食材，素有“食用菌皇后”之美名。我国自2012年实现羊肚菌商业化栽培以来，其人工栽培面积不断扩大，据不完全统计，2021—2022 年生产周期，全国羊肚菌栽培面积近20 000 hm2。

羊肚菌同有些食用菌品种一样，种性经常会出现“退化”现象，表现为菌丝生长变慢，分支减少，活力衰退，产量降低甚至绝产等，最终造成不可估量的经济损失[3-8]。

近年来，陕西省秦巴山区的食用菌产业规模不断扩大，特别是羊肚菌栽培规模已近4 000 hm2；但在发展羊肚菌生产的过程中，当地也遇到诸如菌种质量不稳定、种性易退化等问题。因此，选育获得适应当地气候环境特点且不易退化的稳产羊肚菌菌株成为促进当地食用菌产业健康有序发展的关键。在广泛收集羊肚菌菌株的基础上，通过连续传代培养过程中的菌株稳定性与生产稳定性的相关性研究，选育获得能够适应秦巴山区当地气候环境的稳产羊肚菌菌株，为实现秦巴山区羊肚菌高效稳定的商业化栽培奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株

供试菌株均由陕西省微生物研究所真菌研究中心从各地区采集并经分离、纯化获得，具体编号、采集地及子实体形态见表1。

表1 供试羊肚菌菌株基本情况

（2）培养基及外源营养袋配方

PDA 培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 自然。栽培种培养基：小麦粒50%，杂木屑30%，麸皮9%，生石灰1%，自然土10%。料含水量≥60%，装入聚乙烯袋（15 cm×22 cm）中，121 ℃高压灭菌3 h。外源营养袋：小麦粒52%，玉米芯40%，生石灰1%，石膏1%，磷酸二氢钾0.15%，自然土6%。料含水量≥55%，装入聚乙烯袋（15 cm×22 cm），121 ℃高压灭菌3 h。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离、纯化、鉴定及系统发育学分析

1.2.1.1 菌株的分离、纯化

采用组织分离法分离、纯化菌株。将采集新鲜羊肚菌子实体清洗干净后，于超净工作台中用75%的酒精消毒表面，随后切取菌柄与菌盖连接处的组织块（指甲盖状）接种于PDA培养基上，于23 ℃培养2～3 d。待长出新的菌丝后，铲取菌落边缘的菌丝块接种至空白PDA 培养基上，23 ℃培养2～3 d，同样铲取菌落的菌丝块接种至空白PDA 上培养。如此反复以上操作，直至获得无杂菌污染的纯菌株，于-80 ℃冰箱中保藏备用。

1.2.1.2 分离菌株鉴定

将纯化的羊肚菌菌株接种至PDA 培养基，于23 ℃培养至菌丝长满平板后，刮取部分菌丝用于提取DNA。使用真菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物科技有限公司）提取基因组DNA。用通用引物ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）扩增ITS 序列，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。50 μL 反应体系：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各 2 μL，ddH2O 19 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 70 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR 产物直接交由北京擎科生物科技股份有限公司测序。所得序列在NCBI 数据库中比对分析，并结合形态学进化分离纯化菌株种属的鉴定。

1.2.1.3 系统发育树构建

从NCBI 网站下载六妹羊肚菌M.sextelata及梯棱羊肚菌M.importuna的ITS 序列（GeneBank 号分别为KX809733、MG121861）。用MEGA 7.0 对所获得的ITS 序列进行组装、校对、编辑以及多序列比对。以Morchella rufobrunnea（JX292973）作为外类群，用MEGA7 软件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建系统发育树[9]。

1.2.2 菌株稳定性检测

采用连续传代培养的方法检测羊肚菌菌株的遗传稳定性及其是否容易发生退化。以16株分离、纯化的羊肚菌菌株作为出发菌株，用无菌的打孔器制备直径为5 mm 的接种块，接种于PDA 固体培养基平板（直径15 cm）的边缘，置23 ℃的恒温培养箱中连续培养8～10 d。将以上培养获得的菌丝体作为第一代菌株，于菌丝尖端打孔制备接种块，接种于PDA 培养基上继续进行传代培养。重复以上操作使羊肚菌菌株连续传代培养6～7 代，并测定记录每一代菌株的菌丝生长速度及其菌落的形态特征。

1.2.3 初筛

生产菌种的制备：将前期储藏于-80 ℃冰箱的16 株羊肚菌菌株活化后，接种于PDA 培养基，置23 ℃培养3～6 d。将以上复活后菌株接种于栽培种培养料中，20 ℃暗光培养25～30 d，待菌丝长满料袋后继续培养7～10 d作为生产菌种。

选址和建棚：选择土质疏松潮湿、排水良好的地块（试验大棚位于陕西省商洛市柞水县下梁镇西川村），搭建6 m×35 m×3 m 规格的拱棚，棚上覆盖遮阳网，避免强光直射。

播种及菌丝生长期管理：11 月上旬至下旬播种。于棚内作栽培畦，畦高15 cm，将栽培畦分割为面积5 m2的小区（宽1.5 m，长3.3 m，小区间的距离为0.3 m）。每株供试菌株播种3 个小区。在栽培畦上挖深20～25 cm 播种沟，然后将掰成核桃状的菌种块均匀撒在沟内，播种量为0.5 袋/m2，播种后覆盖10～15 cm 的自然土并适当喷水。菌丝生长期间，主要是土壤含水量的管理，控制土壤含水量 20%～25%即可。

放置营养袋：播种后约10 d，开始放置外源营养袋，在营养袋的一面划一道10 cm 长口，营养袋划口的一面朝向畦面平放，稍压一下袋，使羊肚菌菌丝可以直接接触营养袋中的培养料。羊肚菌菌丝将慢慢长入营养袋中吸收营养，并向土层内的菌丝传送。每个小区均匀放置20～30袋营养袋。

出菇管理：羊肚菌出菇管理期间，应保持大棚温度10～18 ℃、空间相对湿度80%～90%、土壤含水量15%～25%；每天早、晚各通风1 h，保证菌丝生长期间有足够的新鲜空气。随着气温的下降，在12 月中旬最低气温大约5 ℃时，在拱棚上加盖薄膜保温。

采摘及记录：子实体出土7～10 d 后便可生长成熟，一般菌盖颜色变浅、表面蜂窝状凹陷充分伸展即可采收。管理及采收期间观察记录出菇时间、子实体形态等信息，同时统计分析小区产量。

1.2.4 复筛

根据初筛试验结果，选择出菇状况良好的菌株作为出发菌株，于PDA 培养基上连续传代培养5 代（约40 d）后，用于复筛试验。于2021—2022 年在陕西省商洛市柞水县进行复筛试验。根据初筛试验结果调整营养袋放置方式，即将划口数量由1 道变为2道，以使菌丝能充分利用营养袋内的营养物质。每株供试菌株的栽培面积为30 m2/小区（宽1.5 m，长20 m，小区间的距离为0.3 m），3次重复。记录羊肚菌出菇情况，选择具有稳定结实能力的菌株进入中试。

1.2.5 中试试验

将复筛所得的菌株于PDA 培养基上连续传代培养5 代（约40 d）后，用于中试试验。于2022—2023 年在陕西省商洛市柞水县进行中试试验。根据复筛试验结果，优化播种方式，即将覆土层厚度调整为6～9 cm，既可保证土壤含水量和保温效果，又利于通气。每株供试菌株的栽培面积为50 m2/小区（宽1.5 m，长33 m，小区间的距离为0.3 m），3次重复。试验记录羊肚菌出菇情况。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定及系统发育学分析

由图1 可知，羊肚菌菌株SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 与梯棱羊肚菌M.importuna聚为一支，支持率达100%，其他菌株与六妹羊肚菌M.sextelata聚为一支，支持率达92%。根据16株菌株ITS 序列在NCBI 中的比对分析结果，结合形态学分析可知，菌株SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 均为梯棱羊肚菌M.importuna，其他菌株为六妹羊肚菌M.sextelata。

2.2 菌株稳定性

将16株菌株接种至PDA 培养基上，每隔8～10 d取菌落顶端的菌丝块传代一次，并记录每代菌株的菌丝生长速度及菌落的形态特征，结果见图2、图3，表2。

图2 羊肚菌菌丝菌落形态（初始菌株，于PDA培养基中培养3～4 d）

图3 羊肚菌菌丝菌落形态（连续继代培养56 d）

表2 继代培养过程中羊肚菌菌丝生长速率变化 单位：cm/d

由表2 可知，当羊肚菌菌株连续传代培养至第56 天，SMM-01、SMM-03、SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13菌株的菌丝生长速度（平均长速，下同）未发生明显的变化，其他菌株的菌丝生长速度都显著变慢。

由图2 可知，16 株初始羊肚菌菌株菌丝生长速度都较快，菌落边缘都较为整齐，未出现棉絮状的菌落，也未产生明显色素。

由图3 可知，当羊肚菌菌株连续继代培养至第56 天，菌株SMM-04、SMM-16 菌丝生长完全停滞；菌株SMM-02、SMM-05、SMM-10、SMM-14 的菌落呈棉絮状，边缘不整齐，且色素明显；菌株SMM-01、SMM-03、SMM-08、SMM-09、SMM-15 的菌落边缘不整齐，且色素明显；菌株SMM-13的色素明显。

2.3 初筛试验结果

由表3 可知，初筛试验，羊肚菌SMM-04、SMM-05、SMM-08、SMM-09、SMM-10、SMM-15 菌株都未出菇；SMM-01、SMM-02、SMM-03、SMM-14 菌株虽正常出菇，但产量普遍较低（均低于900 kg/hm2），且出菇时间明显长于其他菌株；SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 菌株出菇表现良好，产量均高于1 350 kg/hm2，且出菇时间较短。羊肚菌菌株SMM-06、SMM-07用于后续的复筛试验。

表3 初筛试验结果

2.4 复筛试验结果

由表4 可知，复筛试验，羊肚菌SMM-06、SMM-07 菌株都能正常出菇，且产量及出菇时间同初筛试验结果相比，未发生显著的变化。

表4 复筛试验结果

表5 中试试验结果

2.5 中试试验结果

中试自2022 年11 月24 日开始，至2023 年4 月17 日结束，进入中试阶段的羊肚菌菌株（同初筛试验所用菌株相比，所用菌株均已传代培养10代以上且-80 ℃冷冻保藏了20个月以上）均出菇稳定，且子实体形态较好（图4—5）。中试进一步优化栽培技术，羊肚菌产量与复筛试验相比，有了小幅度地提高。由此可见，羊肚菌SMM-06、SMM-07 菌株是较为适宜秦巴山区气候环境特点的羊肚菌稳产菌株。

图4 人工栽培的羊肚菌SMM-06菌株子实体

图5 人工栽培的羊肚菌SMM-07菌株子实体

3 小结

初筛试验结果与菌株稳定性试验结果发现，凡是在初筛试验中出菇表现良好的羊肚菌菌株（产量高于1 350 kg/hm2），在连续传代培养过程中都具有较好的稳定性，即菌株连续传代6～7 代（培养50～60 d）后，其菌丝的生长速度及菌落形态（主要包括菌落边缘整齐度、菌落是否呈现棉絮状及产生色素状况等）与初始菌株相比，未发生明显的变化。

基于以上发现，复筛试验以连续传代5代（培养约40 d）的羊肚菌菌株作为试验菌株，考察羊肚菌菌株的稳产性，再经中试试验（所用菌株已传代培养10 代，培养约80 d 以上）验证，成功选育出较为适宜秦巴山区气候环境特点的羊肚菌稳产菌株SMM-06、SMM-07。