清热利胆片HPLC 指纹图谱建立及多成分含量测定研究*

乔晓莉，曹宁宁，王清果，刘晓军，张海芳，肖学凤

（1.天津市南开医院，天津 300100；2.天津中医药大学第二附属医院，天津300250；3.天津中医药大学中药学院，天津 301617；4.天津中医药大学研究生院，天津 301617）

清热利胆片是天津市南开医院研制的院内中药制剂，由茵陈、金钱草、夏枯草、大黄、黄芩、厚朴6 味药组成。方中茵陈清利湿热、利胆退黄，且为黄疸要药，为君药；金钱草利湿退黄、利尿通淋，夏枯草清肝泻火、散结消肿，两者合用增强组方利胆之功效，共为臣药；大黄清热泻火、泻下攻积，黄芩清热燥湿、泻火解毒，厚朴燥湿消痰、下气除满，三者共为佐药，泄化湿热。6 味药共奏清热利胆之效，临床用于治疗急性单纯性和轻度化脓性胆囊炎、胆管炎，急性胆囊胰腺炎，胆道术后综合征等，疗效显著[1]。清热利胆片的化学成分复杂，现院内制定的制剂质量控制标准仅测定大黄素和大黄酚的含量，难以对清热利胆片进行较为全面的评价，且目前关于清热利胆片的报道较少，仅1 篇文献测定了清热利胆片中10 个成分的含量[2]。为较全面地反映清热利胆片的内在质量，提高质量评价水平，需建立一套灵敏、稳定的清热利胆片质量评价方法。

中药指纹图谱作为中药质量评价的重要方法，可反映化学成分的整体组成和特征[3]，但无法在“量”上为制剂提供质量保证，而这正是多成分定量分析的优势[4]。中药指纹图谱与多成分含量测定相结合，可更好地反映中药制剂的内在质量，且近年来中药指纹图谱结合多成分含量测定的方法已逐渐应用于中药制剂的质量评价[5]。因此，本研究建立了15 批清热利胆片的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，同时对其中14 个成分进行多成分含量测定，以期提高清热利胆片质量评价水平。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent1260 高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Eclipse XDB-C18色谱柱（美国Agilent 公司）；SHIMADZUAUW120D 分析天平（日本岛津公司）；SHB-Ⅲ循环水式真空泵（河南省予华仪器有限公司）；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品 绿原酸（批号：110753-202119，纯度为96.3%），芦丁（批号：100080-201811，纯度为92.4%），金丝桃苷（批号：111521-201809，纯度为94.9%），迷迭香酸（批号：111871-202007，纯度为98.1%），黄芩苷（批号：110715-202223，纯度为97.2%），槲皮素（批号：100081-201610，纯度为99.80%），芦荟大黄素（批号：110795-201710，纯度为98.3%），大黄酸（批号：110757-201607，纯度为99.30%），大黄素（批号：110756-201512，纯度为98.7%），和厚朴酚（批号：110730-201915，纯度为99.8%），厚朴酚（批号：110729-202015，纯度为99.0%），大黄酚（批号：110796-201922，纯度为99.4%），大黄素甲醚（批号：110758-201817，纯度为99.2%）均购自中国食品药品检定研究院；山奈酚（批号：520-18-3，纯度为98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，DIKMA 公司）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析纯，天津市化学试剂供销公司）；实验用水为娃哈哈饮用纯净水，其他试剂均为分析纯。15 批清热利胆片均为天津市南开医院研制的院内中药制剂，编号分别为S1～S15，具体信息见表1。

表1 清热利胆片样品信息Tab.1 Sample information of Qingre Lidan Tablet

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、芦丁、金丝桃苷、迷迭香酸、黄芩苷、槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为500.33、200.79、101.49、500.52、3005.21、500.62、399.01、350.97、380.28、415.74、898.26、2002.13、967.25、246.92 μg/mL 的混合对照品溶液。测定前用甲醇稀释0、5、10、20、40 和80 倍，得到系列质量浓度的混合对照品溶液。

2.1.2 清热利胆片供试品溶液的制备 取清热利胆片10 片，研细，取约1 g，精密称定，置于塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声（360 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性供试品及单味药材溶液的制备 按照清热利胆片处方制备工艺，制备茵陈、金钱草、夏枯草、大黄、黄芩、厚朴的阴性样品，再按“2.1.2”项下方法制得各阴性供试品溶液。取各单味药材，按“2.1.2”项下方法制备单味药材溶液。

2.2 指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～22 min，5%～20% B；22～61 min，20%～41% B；61 ～67 min，41%～60% B；67 ～74 min，60%～66% B；74～83 min，66%～85% B；83～83.1 min，85%～5% B；83.1～86 min，5% B；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；检测波长：294 nm。

2.2.2 方法学考察 1）精密度实验。取同一份清热利胆片（S7）按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录图谱数据。选取黄芩苷（28 号峰）作为参照，各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.11%～0.25%，相对峰面积的RSD 值为0.20%～0.79%，表明仪器精密度良好。

2）重复性实验。取6 份清热利胆片（S7）按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录图谱数据。选取黄芩苷（28 号峰）作为参照，各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.29%～0.56%，相对峰面积的RSD 值为1.41%～2.93%，表明该方法重复性良好。

3）稳定性实验。取同一份清热利胆片（S7）按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、24 h 进样，记录图谱数据。选取黄芩苷（28 号峰）作为参照，各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.09%～0.23%，相对峰面积的RSD 值为0.96%～1.27%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.2.3 指纹图谱的建立及相似度分析 取15 批清热利胆片按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，将图谱数据导入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）进行数据匹配，以S7 为参照色谱图，采用中位数法，时间窗宽度设为0.1 min，进行多点校正和色谱峰匹配，得到15 批样品的指纹图谱和对照指纹图谱，分别见图1 和图2，共标定出62 个共有峰，计算15 批样品的相似度在0.983～0.996，结果见表2。15 批清热利胆片的指纹图谱相似度均大于0.983，表明清热利胆片批次间一致性良好，整体质量稳定。

图1 15 批清热利胆片HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint chromatogram of 15 batches of Qingre Lidan Tablet

图2 清热利胆片对照指纹图谱Fig.2 Representative fingerprint chromatogram of Qingre Lidan Tablet

图3 清热利胆片样品、混合对照品、各阴性样品及单味药的HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Qingre Lidan Tablet sample，mixed reference substances，negative sample andsingle-flavor medicine

表2 15 批清热利胆片相似度评价结果Tab.2 Similarity evaluation of 15 batches of Qingre Lidan Tablet

2.2.4 共有峰归属与指认 取清热利胆片供试品溶液、混合对照品溶液、各阴性供试品及单味药材溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录图谱数据，并对共有峰进行归属，其中7、12～14、16、17、32、38～40、49、50 号峰归属于茵陈，2、5、7、15、16、22、23、29、30、33、43 号峰归属于金钱草，18、20、21、24、25、53～56 号峰归属于夏枯草，1、3、4、8～14、34～36、38～41、44～52、58、60～62 号峰归属于大黄，19、26～28、32、33、37、42、43、53～56 号峰归属于黄芩，13～15、31、32、46、47、49～52、57、59 号峰归属于厚朴。经对照品比对指认14 个色谱峰，分别为7 号峰绿原酸、16 号峰芦丁、17 号峰金丝桃苷、25 号峰迷迭香酸、28 号峰黄芩苷、33 号峰槲皮素、43 号峰山奈酚、51 号峰芦荟大黄素、52 号峰大黄酸、57 号峰厚朴酚、58 号峰大黄素、59 号峰厚朴酚、60 号峰大黄酚、61 号峰大黄素甲醚。

2.3 多成分含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱条件同“2.2.1”。

2.3.2 方法学考察 1）专属性考察。取空白溶剂、混合对照品溶液、清热利胆片样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，色谱图如图4。结果表明，混合对照品溶液与供试品溶液在相同保留时间处均有相应的色谱峰出现，且空白溶剂指标性成分出峰处无干扰，说明方法专属性良好。

图4 专属性考察色谱图Fig.4 Chromatograms for investigation of specificity

2）线性关系考察。取“2.1.1”项下稀释后的系列质量浓度的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录各对照品的色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标（y），各对照品浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表3，各对照品线性关系良好。

表3 清热利胆片中14 个成分的线性关系考察结果Tab.3 Linear relationship of 14 components in Qingre Lidan Tablet

3）精密度实验。取同一份清热利胆片（S7）按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次。14 个成分峰面积的RSD 值为0.12%～0.85%，表明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。

4）重复性实验。取同一批清热利胆片（S7）6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样。14 个成分峰面积的RSD 值为1.34%～2.10%，表明该方法重复性良好，符合含量测定的要求。

5）稳定性实验。取同一份清热利胆片（S7）按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、24 h 进样。14 个成分峰面积的RSD 值为0.49%～1.26%，表明供试品在24 h 内稳定，符合含量测定的要求。

6）加样回收率实验。取同一批已知含量的清热利胆片（S7）6 份，每份约0.05 g，分别按样品：对照品（1∶1）的比例加入各对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样。14 个成分的加样回收率为98.97%～100.89%，RSD 值为0.37%～2.81%。

2.3.3 样品含量测定 取15 批清热利胆片按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录14 个成分峰面积，计算其在15 批样品中的含量，结果见表4。

表4 15 批清热利胆片中14 种成分含量测定结果（n=3）Tab.4 Results of the 14componentscontent determinationof samples of 15 batches of Qingre Lidan Table（tn=3） mg/片

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 清热利胆片中化学成分复杂，主要含有酚酸类[6-7]、蒽醌类[8]、黄酮类[9-10]、酚类[11]等成分。《中国药典》（2020 年）中，茵陈、金钱草、夏枯草、大黄、黄芩、厚朴含量测定的检测波长分别为327、360、330、254、280、294 nm[12]，为实现多个成分的同时测定，本研究对检测波长进行考察，结果发现在294 nm 波长下，色谱峰数量较多，且峰强度较为适中，基线相对稳定，故选择294 nm 作为检测波长。另外，本研究考察了流动相（水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈、0.2%磷酸水溶液-乙腈）、柱温（30、35、40 ℃）、流动相流速（0.3、0.5、1.0 mL/min），最终确定色谱条件为乙腈-0.1%的磷酸溶液梯度洗脱，柱温35 ℃，流速1.0 mL/min 时，色谱峰峰数较多，紫外吸收较强，峰形对称，分离度较好，且基线较为平稳。

3.2 指纹图谱结果分析 15 批清热利胆片的HPLC 指纹图谱共确定62 个共有峰，并指认出其中14 个成分。以峰形、分离度较好的黄芩苷为参照峰，15 批清热利胆片样品相似度较高，各成分保留时间稳定，表明所建立的指纹图谱方法稳定可靠。相似度评价结果显示，15 批清热利胆片的指纹图谱相似度均大于0.983，表明清热利胆片批次间一致性良好，化学成分基本一致，整体质量稳定。

3.3 指标成分的选择 清热利胆片由茵陈、金钱草、夏枯草、大黄、黄芩、厚朴6 味药组成，绿原酸、槲皮素、山奈酚、迷迭香酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷、厚朴酚和厚朴酚分别为《中国药典》（2020 年版）规定的6 味中药含量测定指标成分[12]。且现代研究表明，以上成分具有保肝、抑制肝纤维化、促进胆汁分泌等药理作用，如绿原酸、厚朴酚和和厚朴酚对四氯化碳（CCl4）所致肝损伤小鼠具有肝保护作用[13-14]，其中绿原酸还可通过抑制TLR4（Toll 样受体4）/NF-κB（核因子-κB）信号通路来预防刀豆蛋白（Con A）诱导的小鼠肝炎[15]；金丝桃苷可减轻急性酒精性肝损伤小鼠的肝纤维化和损伤[16]；山奈酚可下调脂多糖诱导的Kupffer 细胞活化及HIF-1α/HK2 表达，抑制糖酵解和乳酸生成，显著减少炎性反应和氧化应激，进而发挥肝细胞保护作用[17]；槲皮素可降低肝脏中总胆汁酸水平，同时升高血清中总胆汁酸水平[18]；芦丁为槲皮素的一种糖苷，能够有效改善经前烦躁障碍肝气逆证的情绪和躯体症状[19]；迷迭香酸和黄芩苷可以抑制肝星状细胞中典型Wnt 信号介导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达，从而抑制胆汁淤积性肝纤维化[20]。研究发现大黄总蒽醌能够减轻肝损伤，有效改善肝纤维化[21-22]，其中大黄素可通过调节氧化应激、减轻肝细胞凋亡从而减轻脂多糖诱导的急性肝损伤[23]；大黄酚和大黄素甲醚可减轻非酒精性肝损伤和酒精性肝损伤的肝脂肪变性[24-25]；芦荟大黄素可减轻内质网应激引起的肝细胞脂质代谢紊乱[26]；大黄酸抑制肝星形细胞激活，来降低胆汁淤积性肝纤维化程度[27]。因此，以上成分为清热利胆片的保肝利胆药效相关成分。

本研究共选择14 个成分作为质量控制的成分，其中绿原酸为君药茵陈的指标成分，迷迭香酸为臣药夏枯草的指标成分，黄芩苷为黄芩的指标成分，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均为佐药大黄的指标成分，厚朴酚和厚朴酚为佐药厚朴的指标成分；槲皮素、山奈酚和芦丁为茵陈、金钱草和夏枯草的共有成分，金丝桃苷为茵陈和夏枯草的共有成分。这14 个成分的选择，既考虑到君臣佐的配伍意义，又兼顾保肝利胆药效作用，提高了清热利胆片质量评价的水平。

3.4 含量测定结果分析 本研究通过混合对照品比对指认了14 个共有峰，分别为绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚、芦丁、迷迭香酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷、厚朴酚、和厚朴酚。在此基础上，对指认出的成分进行含量测定，测得其平均含量分别为（0.31±0.04）（0.04±0.01）（0.25±0.02）（0.20±0.06）（0.10±0.02）（0.23±0.05）（0.17±0.01）（0.19±0.02）（0.18±0.03）（0.56±0.08）（0.14±0.02）（1.98±0.17）（1.03±0.12）（0.65±0.04）mg/片。

本研究建立的清热利胆片HPLC 指纹图谱及14 个成分含量测定方法稳定可靠、操作简便，可为清热利胆片的质量评价提供参考。