干酪乳杆菌复合冻干保护剂工艺优化

■ 周雷进雨 马精阳 袁月明 李锦生 冯伟志 周丽娜

（吉林农业大学工程技术学院，吉林长春 130118）

干酪乳杆菌作为一种重要的乳酸菌，已被广泛应用于食品、医疗、微生物制剂和畜牧业等领域[1-2]。真空冷冻干燥是目前制备高品质乳酸菌制剂的重要方法之一，与传统干燥技术相比，具有便于运输、贮藏期长等特点[3]。但在冻干过程中，由于多种因素的变化，会导致细胞活力下降，甚至会造成菌体的死亡[4]。在冻干前添加保护剂，可以减少冻干过程中所带来的损害，使其尽可能保持原有的理化性质和生物活性[5-9]。

干酪乳杆菌能够促进免疫反应，有利于宿主健康，研究表明，将干酪乳杆菌应用到养殖业中，能够有效地改善动物的健康以及生长性能，这对绿色生态养殖具有重要的意义[10-11]。复合冻干保护剂能够有效地提高菌种在运输过程中的存活率，因此，在实际生产中具有较好的应用前景。

为了提高冻干后菌种的存活率，本研究通过采用单因素试验设计筛选出各种类别冻干保护剂中对菌种存活率有显著影响的材料，进一步通过响应面法对筛选出的保护剂材料进行复配优化，并以菌株的存活率为响应指标，探究一种干酪乳杆菌复合冻干保护剂的制备工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）粉剂由中国科学院微生物研究所提供，由吉林农业大学动物科学技术学院实验室分离保藏。

1.1.2 试剂

山梨醇、甘露醇、甘油、硫代硫酸钠，购自浙江一诺生物科技有限公司；蔗糖、明胶、磷酸钠、谷氨酸，购自辽宁众发生物科技有限公司；海藻糖、乳糖，购自山东优索化工科技有限公司；维生素E，购自安徽酷尔生物工程有限公司；蛋白胨，购自上海博微生物科技有限公司；山梨醇、甘露醇、甘油、硫代硫酸钠、蔗糖、明胶、磷酸钠、谷氨酸、海藻糖、乳糖、维生素E、蛋白胨均为分析纯，净含量均为500 g。

1.1.3 仪器设备

GR85DR 型高压蒸汽灭菌锅（北京盛科信德科技有限公司）；超净工作台（冠森生物科技有限公司）；Centrifuge5702 型离心机（上海普瑾医疗科技有限公司）；CryoCubeF570型超低温冰箱（购自上海蓓米尔生物科技有限公司）；电子天平（上海长耀仪器有限公司）；低温保存箱（购自青岛海尔集团）；LRH-150型恒温生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

活菌计数→离心5 min（3 000 r/min）→与冻干保护剂混合（单一、复合）→分装→预冷冻24 h→超低温冷冻1 h→冷冻干燥24 h→复水→活菌计数→菌种保护率[12]。

1.2.2 菌种活化

无菌条件下，取出菌种冻干粉，室温解冻5 min后，按照2%的接种量接种到MRS 液体培养基中，并将其摇匀。在37 ℃恒温条件下经过48 h 培养后得到一代菌，再经过48 h 培养后，得到二代菌，用于试验[13-14]。

1.2.3 预冷及冻干

将所制备的样品进行预冷冻24 h，预冷冻环境为-20 ℃[15]，预冷冻完成后放入-80 ℃环境中冷冻1 h[16]，最后进行冷冻干燥操作，冷冻干燥环境条件为真空度3.08 Pa，温度-85 ℃，冷冻干燥时间为24 h[17-18]。

1.2.4 单一种类保护剂材料的制备和选择

采用单因素试验考察不同类型保护剂对冻干后干酪乳杆菌菌种存活率的影响，控制预冷和冻干的试验条件不变，以冷冻后菌种存活率为指标，对冷冻保护剂、抗氧化剂、酸碱调整剂和填充剂进行筛选，筛选出各类保护剂中冻干后菌种存活率最高的材料。将冷冻保护剂（蔗糖、海藻糖、甘油）、抗氧化剂（硫代硫酸钠、维生素E、蛋白胨）、酸碱调整剂（磷酸、氨基酸、山梨醇）、填充剂（甘露醇、乳糖、明胶）中的每种材料分别同纯化水混合成单一成分保护剂，其中冷冻保护剂和填充剂以10%的浓度进行混合[19]，抗氧化剂和酸碱调整剂以1%的浓度进行混合[20]，混合完成后与菌体完全接触并摇匀，进行预冷冻和冷冻干燥。每组材料进行3次重复试验，最后取平均值。

1.2.5 复合保护剂的响应面法优化

如表1 所示，以单因素试验筛选出来的海藻糖、硫代硫酸钠、甘露醇、山梨醇为原料，以冷冻后菌种的存活率为指标，使用三水平四因素的响应面试验来进行复配优化，以此来确定复合保护剂的最佳配比。

表1 复合冻干保护剂各因素的水平选择

1.2.6 活菌计数

在无菌条件下，将0.1 g 冻干粉溶于0.9 mL 的无菌水中，充分混合后备用，用无菌水将所得的菌悬液进行梯度稀释，将菌液用涂布棒均匀涂布到固体培养基上，在37 ℃恒温条件下培养48 h 后，取出并计数[21]。冷冻前的菌种数量为 5.1×109CFU/mL。

1.2.7 菌种存活率

式中：m——冷冻干燥后测得的活菌数量（CFU/mL）；

m0——冷冻干燥前测得的活菌数量（CFU/mL）。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010 软件对试验数据进行统计分析，利用Design-Expert 13.0 软件进行响应面试验设计，并分析试验结果，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 单一保护剂的确定

为了提高菌种在冻干过程中的存活率，以A（海藻糖）、B（甘油）、C（蔗糖）这3种材料为冷冻保护剂的试剂分别进行试验，结果如图1所示，海藻糖对菌种的保护效果最优，显著高于甘油和蔗糖（P＜0.05），蔗糖对菌种的保护效果最差，测得海藻糖组的菌种存活率为70.6%，甘油组和蔗糖组的菌种存活率分别为54.9%和39.2%。因此，选择海藻糖作为冷冻保护剂材料。

图1 冷冻保护剂对菌种存活率的影响

为了提高菌种在冻干过程中的存活率，以A（硫代硫酸钠）、B（蛋白胨）、C（维生素E）这3 种材料为抗氧化剂的试剂分别进行试验，结果如图2 所示，硫代硫酸钠对菌种的保护效果最好，显著优于维生素E 和蛋白胨（P＜0.05），维生素E 对菌种的保护效果最差，测得硫代硫酸钠组的菌种存活率为52.9%，蛋白胨组和维生素E 组的菌种存活率分别为31.3%和25.5%。因此，选择硫代硫酸钠作为抗氧化剂材料。

图2 抗氧化剂对菌种存活率的影响

为了提高菌种在冻干过程中的存活率，以A（甘露醇）、B（明胶）、C（乳糖）这3种材料为填充剂的试剂分别进行试验，结果如图3 所示，甘露醇对菌种的保护效果最佳，显著高于乳糖和明胶（P＜0.05），乳糖对菌种的保护效果最差，测得甘露醇组的菌种存活率为45.1%，明胶组和乳糖组的菌种存活率分别为29.4%和11.8%。因此，选择甘露醇作为填充剂材料。

图3 填充剂对菌种存活率的影响

为了提高菌种在冻干过程中的存活率，以A（山梨醇）、B（磷酸）、C（谷氨酸）这3种材料为酸碱调整剂的试剂分别进行试验，结果如图4 所示，山梨醇对菌种的保护效果最优，显著高于磷酸和谷氨酸（P＜0.05），谷氨酸对菌种的保护效果最差，测得山梨醇组的菌种存活率为58.8%，磷酸组和谷氨酸组的菌种存活率分别为37.2%和9.8%。因此，选择山梨醇为酸碱调整剂材料。

图4 酸碱调整剂对菌种存活率的影响

如表3 所示，本研究构建的回归模型极显著（P＜0.01），说明模型的可靠度较高，可以利用该模型指导干酪乳杆菌复合冻干保护剂工艺优化。通过方差分析可以得出，4 个因素对冷冻后的活菌数的影响主次顺序为：A＞D＞B＞C；即海藻糖＞山梨醇＞硫代硫酸钠＞甘露醇。通过比较P值，可以得出B、C、AB、AC、AD、BC、BD、CD、D2对冷冻后活菌数影响不显著（P＞0.05），同时也说明4个因素之间没有交互作用；A对冷冻后的活菌数影响极显著（P＜0.01）。说明在冷冻干燥过程中，冷冻保护剂对菌种提供的保护效果最明显。

2.2 复合保护剂的确定

为了进一步探究复合冻干保护剂对干酪乳杆菌菌种存活率的影响，以单因素试验筛选出的海藻糖、硫代硫酸钠、甘露醇、山梨醇为供试材料，利用Box-Behnken 模块进行响应面试验，探究不同浓度的复合保护剂对菌种存活率的影响，结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验结果

软件Design-Expert 13.0所得的拟合回归方程：

Y=42-6.58×A-1.58×B+1.17×C+5.33×D+0.5×AB-1.5×AC+0.75×AD-2.25×BC+4×BD+0.25×CD-15.5×A2-6.75×B2-6.62×C2+0.625×D2

拟合回归方程的方差分析见表3。

表3 拟合回归方程的方差分析

2.3 各因素交互作用的分析

通常情况下，响应面的等高线越接近于椭圆，则说明各因素间的交互作用越明显；且当响应曲面越陡时，也能说明各因素间的交互作用越强。

由图5 可知，各因素交互作用的等高线没有表现为明显的椭圆形，同时响应曲面也呈现为相对平缓，说明各因素间的交互作用并不显著，同上述的回归分析结果相一致。

图5 各因素交互作用的等高线和响应面

2.4 复合保护剂最佳配比的效果验证

根据上述模型可以得出复合冻干保护剂的最佳配比为海藻糖15%、甘露醇15%、山梨醇3%、硫代硫酸钠2%，以菌种存活率为指标，利用该配比与5.1×109CFU/mL 浓度的菌种进行混合试验。试验结果如表4所示。

表4 复合保护剂最佳配比的结果验证

由表4 可知，利用该配比制作的复合保护剂进行试验，经过576 h 的冷冻后，测得的菌种存活率为90%，在冷冻时间为576～672 h，菌种的存活率有所下降，降低了2%，冷冻672 h 后测得的菌种存活率为88%，说明该复合冻干保护剂能够达到比较理想的保护效果。

3 讨论

冷冻干燥是制备乳酸菌制剂的重要环节，在冻干前添加保护剂能够有效保持菌种在冻干过程中的稳定性，提高菌种存活率。不同保护剂的保护机制不同，单一保护剂一般不能达到良好效果。本研究在进行复合冻干保护剂复配优化时，考虑到干酪乳杆菌在冷冻干燥过程可能受到多种因素影响，因此选择冷冻保护剂、抗氧化剂、酸碱调整剂和填充剂进行加强或协同作用。复合冻干保护剂对菌种具有良好的保护效果，能够有效的降低干酪乳杆菌在冻干过程中由工艺造成的失活或死亡，从而提高菌种的存活率，且保护效果作用时间较长，能够有效解决实际生产中长期储存困难的问题。

本研究所选择的各类试剂对冻干后干酪乳杆菌均具有一定的保护效果，在冷冻保护剂中海藻糖对菌种的保护作用最佳，且在复配优化试验中，海藻糖对冻干后的菌种存活率影响最显著。海藻糖属于非还原性糖，具有特殊的双糖分子结构，当细胞处于冷冻干燥条件时，其能够在细胞表面形成保护膜，可以较好地维持细胞膜的稳定性，从而能够减少菌种细胞的死亡，提高菌种的存活率[22-24]。在抗氧化剂中硫代硫酸钠对菌种的保护作用最佳，硫代硫酸钠的抗氧化效果是通过自身氧化来提供的，当试管环境中的氧和冻干品内部的氧被消耗掉后，冻干品所接触到的氧含量也会降低，使得氧化反应也会减少，从而达到抗氧化效果[25]。在填充剂中甘露醇对菌种的保护作用最佳，甘露醇具有难被空气氧化、易溶于水的特性，在冷冻干燥过程中，甘露醇在慢速冻结时会结晶，从而为活性组分提供支撑结构，不仅能够保护细胞，还不会与活性组分发生反应，从而能够提高菌种的存活率[26-27]。在酸碱调整剂中山梨醇对菌种的保护作用最佳，山梨醇是多元醇类，其不仅能够调节酸碱度，还能够为活性组分提供支撑结构，对菌体起到了双重保护的作用[28]。

利用制备的复合冻干保护剂对干酪乳杆菌进行冻干后的菌种存活率达到了90%，与单一类别保护剂作用效果相比较，复合冻干保护剂的保护效果均优于各类单一类别保护剂。说明复合冻干保护剂能够有效降低细胞流动性，维持细胞膜的稳定性和保护细胞内代谢酶活性等[29-31]。通过验证试验可以得出经过672 h 冷冻干燥后，菌种存活率为88%，说明该配比的复合冻干保护剂对干酪乳杆菌具有良好的长期保护效果。

4 结论

本研究通过单因素试验设计，从12 种材料中筛选出对菌种存活率有显著影响的海藻糖、硫代硫酸钠、甘露醇、山梨醇这4 种试剂，这4 种试剂对菌种的保护效果最明显。在单因素试验的基础上，通过复配优化试验对干酪乳杆菌复合冻干保护剂的配比进行优化，试验结果表明，最佳配比组合为A2B2C2D3，即海藻糖15%、甘露醇15%、山梨醇 3%、硫代硫酸钠2%，在该配比下，冷冻后活菌数量为4.6×109CFU/mL，菌种存活率为90%。经过672 h 的混合试验验证，得到的菌种存活率为88%。