基于MALDI - TOF MS 技术快速鉴定奶牛乳腺炎奶样中疑似金黄色葡萄球菌

刘 宇,张忠兵,徐晓枫,蒲云霞,王利平,吴琼海,琚 波,希尼尼根*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院 内蒙古 呼和浩特 010018;2.内蒙古综合疾病预防控制中心,内蒙古 呼和浩特 010080)

奶牛乳腺炎作为奶牛最常见的流行疾病之一,对动物福利和奶业健康发展产生严重的影响。该病的流行可导致奶牛产奶量下降、牛奶品质下降、抗生素滥用等问题发生[1-3]。奶牛乳腺炎在我国发病仍较为频繁,其中临床型乳腺炎发病率为 9.7%～55.6%,隐性乳腺炎发病率为61.03%～79.62%[4],每年因奶牛乳腺炎所造成的经济损失高达30亿元[5]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)作为引起奶牛乳腺炎的主要病原体之一,可在人与动物之间交叉传播引发疾病[6];同时,S.aureus对机体的免疫逃避机制和对抗生素的耐药性导致该病治疗复杂化,致使公共卫生和食品安全面临巨大的挑战[7-8]。因此及时准确鉴定S.aureus对疗奶牛乳腺炎预防、治疗和控制具有重要意义。

目前,S.aureus的检测主要包括传统的生化鉴定、免疫学鉴定、分子生物学和量子点标记等鉴定方法[9];传统生化试验因为操作过程繁杂、时间过长和结果偏差大等问题无法满足微生物的快速鉴定。免疫学鉴定虽然缩短了检测时间,但其工作原理为抗原抗体结合,易受其他代谢产物影响,假阳性率升高[10-11]。随着分子生物学技术的广泛应用为S.aureus的快速鉴定提供了帮助,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为近些年快速发展的检测技术,已经广泛用于微生物快速鉴定、分型和耐药性检测;该技术将表型分析与分子分析有机结合起来,通过采集目标菌核糖体蛋白质获取特异性的指纹图谱,将获取的特异性指纹谱图与数据库中已有图谱进行比对分析,实现待测菌株在属、种水平的鉴定[12-15]。该方法具有操作简便、快速、准确、高通量和成本低等优点。

本试验通过MALDI-TOF MS技术对乳腺炎奶样中分离菌株进行快速鉴定,同时选用荧光定量PCR和nuc基因的PCR扩增等方法进行方法比较,分析MALDI-TOF MS方法在鉴定S.aureus的准确程度,同时对鉴定菌株进行聚类分型及分析,为奶牛乳房炎的防控和可能污染源的追溯提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株来源本试验中45株疑似菌株均由奶牛临床型乳房炎奶样中分离获得,3株标准菌株S.aureusATCC29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)ATCC35984和大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922均由内蒙古疾病预防控制中心提供。

1.2 主要仪器MALDI-TOF MS 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪,购自郑州安图生物科技工程公司;PCR扩增仪、电泳仪和凝胶成像系统均购自伯乐公司;荧光定量PCR仪、全自动核酸提取仪购自硕世生物科技有限公司。

1.3 主要试剂营养琼脂(NA)、S.aureus选择性培养基(BP)和血平板均购自北京路桥技术股份有限公司;甲酸(FA)、乙腈(ACN)、无水乙醇和三氟乙酸(TFA)由赛默飞世尔公司提供;α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)和细菌试验校准品(BTS)由郑州安图生物科技工程公司提供;Premix由日本TAKARA公司提供;荧光定量PCR引物和探针、耐热核酸酶(nuc)扩增引物(表1)[16-17]、SDS、Tris均购于上海生工生物工程有限公司;DNA提取试剂盒由硕世生物科技有限公司提供。

表1 引物名称及序列

1.4 葡萄球菌的分离将呼和浩特地区13家牧场采集的257份临床型乳房炎奶样摇匀后吸取25 mL分别加到225 mL氯化钠营养肉汤的匀质袋中,置于37℃恒温培养箱中增菌培养18～24 h;将增菌液分别划线接种到Baird-Parker平板37℃恒温培养18～24 h;挑取特征菌落接种到血平板,再次置于恒温培养箱培养18～24 h。挑取特征菌落进行革兰染色、镜检后,将获得的45株葡萄球菌保存备用。

1.5 MALDI-TOF MS 鉴定方法

1.5.1提取法处理 取300 μL去离子水或超纯水加入到1.5 mL离心管中,用接种环刮取待测菌落5～10 mg至离心管中并混匀;向离心管中加入900 μL无水乙醇混匀;14 000 r/min离心4 min,弃上清液后再次离心2 min。用移液枪将残留液体吸净,此过程不能接触沉淀;室温干燥1～2 min后加入50 μL 70%甲酸,充分混匀;再加50 μL乙腈进行混匀;14 000 r/min离心2 min后将上清液转移至新离心管中备用。分别取1 μL待测提取液和细菌校准液(BTS)置于MALDI靶板上,室温晾干后滴加1 μL HCCA基质液,待充分晾干后进行检测。

1.5.2MALDI-TOF MS检测 仪器参数设置:线性模式为正离子P采集模式;检测器2.65 kV,推迟极20 kV,引出极1.9 kV,聚焦极1.00 kV,激光频率330 Hz,相对分子质量范围2 000～20 000 Da。将载有待测液和校准液的靶板送入质谱仪内,用采集软件进行特征指纹谱图的采集,试验开始时先用校准液对仪器进行校准,校准通过后开始对待测样本进行采集。将采集的蛋白质指纹图谱与数据库中标准菌株指纹图谱比对分析,通过比对质核比(m/z)和特征峰得到鉴定结果;并将采集的指纹图谱使用分析软件进行聚类分析[18-19]。

1.5.3结果判定 数据库给出与鉴定菌株最为匹配的10株菌株,并给出相应分值及种属。鉴定分数在9.500～10.000区间内,表明该匹配结果种水平置信及可能的亚种[20];分值在9.000～9.500区间内,表明该匹配结果种水平置信;分值在6.000～9.000区间内,表明该匹配结果属水平置信;分值在6.000以下,表明该匹配结果不可置信。

1.6S.aureusnuc基因鉴定按照全自动核酸提取仪操作要求,分别提取各待测菌株基因组DNA;对待测菌株进行nuc基因PCR扩增试验,同时以大肠杆菌(ATCC25922)、S.aureus(ATCC29213)和表葡菌(ATCC35984)做实验对照。50 μLnuc基因PCR扩增体系:Premix(包括缓冲液、氯化镁、dNTP、聚合酶等)25 μL、DNA模板2 μL、引物nuc-F和nuc-R各2 μL、ddH2O 19 μL;PCR反应程序:95℃预变性5 min、95℃变性1 min、49℃褪火30 s、72℃延伸20 s,进行30个循环,72℃总延伸5 min。扩增结束后进行电泳试验,阳性产物送至上海进行基因测序,将nuc基因序列利用NCBI软件BLAST进行比对。

1.7 荧光定量PCR鉴定将提取好的S.aureus基因组DNA进行扩增。20 μL反应体系:qPCR SuperMix(包括缓冲液、氯化镁、dNTP、聚合酶等)10 μL、上、下游引物及探针各0.5 μL、DNA模板2 μL,补双蒸水至20 μL;反应程序:预变性95℃ 3 min;95℃ 5 s、55℃ 60 s,再进行40个循环。Ct值≤36则判定为阳性。

2 结果

2.1 MALDI-TOF MS 检测结果及分析通过采集软件对45株疑似菌株进行图谱分析,其中43株报告为S.aureus(表2),检出率为95.6%(43/45)。其中C2、E1等28株匹配分值大于9.500,表明该匹配结果种水平置信及可能的亚种;C3、E9等15株匹配分值大于9.000,表明该匹配结果种水平置信;其余2株L11和F4分析鉴定为产色葡萄球菌。对43株S.aureus的主要离子峰进行综合分析,其主要集中在2 000～10 000 Da区间内。在质荷比为(m/z)2 763,3 445,4 816,5 528,6 892,9 633等12处存在特征峰,各菌株特征峰基线平稳、重复性好、响应值高,图谱质量较高,如图1所示。同时将各菌株特征峰与数据库内S.aureus特征峰进行比对分析,0轴以上为待鉴定菌株主要特征峰图谱,0轴以下为数据库S.aureus特征峰图谱,两者成镜像关系的比率越大,则鉴定为同种菌株的可能性则越大,分值则越高。以R121菌株、ATCC29213为例,比对后得到分值分别为9.554和9.509,说明R121与数据库中S.aureus镜像比率更高,差异程度更低(图2)。

A.43株S.aureus特征峰重复性谱图;B上.R121菌株质谱图;B下.ATCC29213标准菌株质谱图

A.R121;B.ATCC29213

M.DL1200 DNA Marker;P.ATCC29213 S.aureus参照菌株;1～13.为表2中1～13号菌株;B.ATCC35984表葡菌参照菌株;N.ATCC25922大肠杆菌参照菌株

2.2 荧光定量PCR检测结果通过荧光定量PCR对45株疑似菌株进行检测,43株检测结果为阳性,2株呈阴性,与MALDI-TOF MS和nuc基因PCR扩增鉴定一致,统计结果见表2。

2.3nuc基因PCR扩增及序列分析将45株疑似菌株进行nuc基因PCR扩增,以S.aureusATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC35984、大肠杆菌ATCC25922作为试验对照。43株S.aureus和S.aureusATCC29213均扩增出264 bpnuc基因条带(图3),与上述2种方法鉴定结果一致(表2)。表皮葡萄球菌ATCC35984、大肠杆菌ATCC25922、L11和F3未扩增出基因条带。并对L11和F3的菌株进行16S rRNA进行扩增和测序,鉴定为产色葡萄球菌。对扩增nuc条带进行BLAST在线比对,亲缘关系均为S.aureusnuc片段,且同源关系为98.5%～100%。

2.4 MALDI-TOF MS 聚类分析结果及分析通过对43株S.aureus指纹图谱进行聚类分析,按照特征峰相似性得到树状图,以距离表示同源性关系,差异程度为0～1 000,数值越大表明同源性越低。如图4所示。图中将43株菌株归为同一类,这与MALDI-TOF MS鉴定的结果一致,同时图4直观的体现了43株S.aureus的相关性及同源性。在差异度800时,可分为2个型,说明两型间菌株分子水平差异较大,同源关系较远;在差异度500时,主要可分为5个型,且各型内菌株大多数来源于各自牧场中,说明同一牧场内多数菌株在分子水平差异较小,存在一定程度的同源关系,为牧场进一步对污染源的追溯及防控提供支持。

图4 43株S.aureus MALDI-TOF MS 聚类分析图

3 讨论

MALDI-TOF MS作为近期发展的一种微生物快速鉴定的方法,是对传统和分子鉴定方法的补充,其原理是通过获取细菌特异性蛋白图谱与数据库中标准菌株图谱进行分析比较,获得更为准确和直接的结果[21]。它具有处理方法简便、鉴定结果快速、准确性高、灵敏度高、高通量和成本低等优点,使得被广泛用于医疗、环境和食品领域中,但设备价格及维护费用高昂致使一些实验室无法承担。其次菌株的培养、基质的选择以及数据库等因素也会影响试验结果[22-23]。

本试验中采用MALDI-TOF MS对45株疑似葡萄球菌株进行鉴定分析,43株鉴定为S.aureus,均能被鉴定到种水平。其中28株S.aureus匹配分值为大于9.500,占比为65.1%(28/43);15株S.aureus匹配分值大于9.000,占比为34.9%(15/43);与荧光定量PCR和nuc基因PCR扩增鉴定结果一致,进一步验证了MALDI-TOF MS鉴定的可靠性。但基于鉴定时间和通量而言,荧光定量PCR检测96个样本需要约4h,细菌保守片段扩增测序需要约8-10小时,MALDI-TOF MS约需2 h,且1次最多可以检测384个样本,MALDI-TOF MS鉴定方法效率更高。就鉴定结果和准确性而言,3种方法均可以将S.aureus鉴定到种属,且准确率为100%。同时,MALDI-TOF MS通过获得指纹谱图进行聚类分析,根据菌株之间差异水平进行分型,分析各菌株间的亲缘关系,实现对不同来源的污染菌株进行追溯。

综上,MALDI-TOF MS适用于对S.aureus分离株的快速鉴定,可用于临床上快速诊断;同时对S.aureus进行快速聚类分析,对于预防和控制S.aureus引起的奶牛乳腺炎提供了技术支持。