ROS对PA诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

曹一鸣,温小庆,付世新

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院,黑龙江 大庆 163319)

围产期由于能量摄入和输出的不平衡导致机体处于能量负平衡状态。能量负平衡会导致奶牛机体脂肪大量动员,引发高游离脂肪酸(nonestesterified fatty acid,NEFA)血症,而高NEFA具有脂毒性,能造成围产期奶牛代谢紊乱、免疫抑制和繁殖障碍等,其中奶牛胎衣不下(retained fetal membranes,RFM)是与其密切相关的繁殖障碍疾病,高NEFA血症可增加奶牛患胎衣不下的风险[1-2]。

NEFA是由油酸、棕榈酸(palmitic acid,PA)、硬脂酸及少量花生四烯酸组成的混酸。PA是NEFA中含量最高的饱和脂肪酸,约占NEFA的34%[3],可对Saos-2细胞、BV2小胶质细胞等的增殖和凋亡造成影响,而且内质网应激和自噬也参与了PA导致的Saos-2细胞的凋亡,具有广泛的生物学功能。

奶牛胎衣不下的发生与细胞凋亡及机体抗氧化状态密切相关[4]。氧化应激(oxidative stress,OS)通常是由于外界不良刺激的影响下,机体先天的抗氧化防御机制被破坏,造成活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多,从而导致细胞、组织和器官的抗氧化能力下降,出现生理和病理变化[5]。研究表明PA能够对呼吸链造成破坏,从而导致生物学功能紊乱引起氧化损伤,而NEFA可以使SOD、GSH-PX等抗氧化酶受到抑制,进而导致奶牛OS[6-7]。研究表明PA具有脂毒性,可以破坏细胞稳态,使细胞内的功能发生紊乱,当细胞长时间处于应激状态时,就会导致细胞发生凋亡[8]。本试验通过研究ROS对PA诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响,探讨PA在胎衣不下发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料胎牛血清购自杭州四季青公司;青链霉素、胰酶、Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂盒、ROS检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;RPMI Medium 1640培养基购自Gibco; PA、抗氧化剂(NAC)购自Sigma;超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测试盒、微量还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 奶牛原代子宫内膜上皮细胞的分离培养所用的奶牛原代子宫内膜上皮细胞是使用贴壁法培养得到的,经纯化后,该细胞的纯度可达90%以上,完全满足试验所需。原代子宫内膜上皮细胞传代至3～8代时活力最佳,所有细胞试验所用细胞都在此范围内。

1.3 PA及抗氧化剂(NAC)的制备取3 g牛血清白蛋白(BSA)粉末,加入10 mL超纯水后,充分混匀得到30%的BSA储备液10 mL,将其置于55℃水浴锅中30 min后备用;将0.035 g氢氧化钾(KOH)加入到50 mL的超纯水中,充分混匀,加入0.16 g的PA,在水浴锅中加热到70℃,配制成12.5 mmol/L的PA;在12.5 mmol/L的PA中加入800 μL的30% BSA、1 200 μL的0.05 mmol/L HCl,充分混匀,定容为10 mmol/L PA待用。将2 g NAC粉末加入到24 mL的PBS中配制成500 mmol/L的NAC储备液待用。

1.4 PA最适添加浓度和时间的筛选添加不同浓度的PA(0,0.2,0.4,0.6,0.8和1 mmol/L)分别刺激奶牛子宫内膜上皮细胞6,12 和24 h后检测细胞存活率,具体步骤参考CCK-8试剂盒说明。

1.5 细胞处理将培养的奶牛子宫内膜上皮细胞以2×106接种到6孔板,添加正常培养基生长24 h,当细胞生长到80%～90 %时,用新的无血清培养基取代此培养基饥饿培养12 h。对照组:用新的无血清培养基取代原先的细胞培养基,培养12 h;PA组:将原先的细胞培养基弃掉后,添加0.6 mmol/L的PA,培养12 h后收集细胞;PA+NAC组:试验前2 h将原先的细胞培养基换成无血清培养基,加入10 mmol/L的NAC储备液处理2 h,然后添加0.6 mmol/L的PA,培养12 h后收集细胞;NAC组:将原先的细胞培养基弃掉后加入10 mmol/L的NAC储备液,培养12 h后收集细胞。

1.6 添加PA及NAC后上皮细胞氧化及抗氧化指标的检测收集各组细胞,利用SOD测定试剂盒、MDA检测试剂盒、GSH检测试剂盒检测氧化及抗氧化指标,具体步骤参考说明书。

1.7 添加PA后上皮细胞ROS含量及细胞凋亡率的检测收集细胞,PBS清洗2次后弃上清,每个样品添加200 μL 的DCFH重悬,37℃避光孵育20 min后,用无血清培养基清洗2次后上机检测ROS含量。收集细胞,PBS清洗2次后弃上清,每个样品添加198 μL 1×Binging Buffer 重悬细胞并添加1 μL的Annexin V-FITC和1 μL的PI,设单染对照组FITC组(只标记FITC)、PI组(只标记PI)和空白组(不标记),室温避光孵育15 min后每个样添加300 μL PBS混匀,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 不同浓度PA对奶牛子宫内膜上皮细胞存活率的影响分别添加不同浓度的 PA(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞不同时间(6,12,24 h),比较了PA对细胞活力的影响。如图1所示,随着作用时间的增加,不同浓度的PA组间差异逐渐显著,并发现细胞活力与PA的浓度间呈浓度依赖性。当作用12 h时组间差异开始明显,结合每组细胞活力下降的显著性,我们选取12 h作为后续试验的作用时间。当作用时间为12 h时,PA浓度为0.2 mmol/L时细胞活力下降不明显,当PA浓度为0.4 mmol/L时细胞活力下降显著(P<0.05),当PA浓度为0.6 mmol/L时细胞活力极显著下降(P<0.01)。所以选用0.2,0.4,0.6 mmol/L这3个具有代表性的浓度进行后续试验。

与对照组比较,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 PA对奶牛子宫内膜上皮细胞ROS含量的影响分别添加不同浓度的 PA(0.2,0.4,0.6 mmol/L)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞12 h后,如图2所示,当PA浓度为0.4 mmol/L时与对照组相比ROS含量显著增加(P<0.05),当PA浓度为0.6 mmol/L时与对照组相比ROS含量极显著增加(P<0.01)。

图2 不同浓度PA对奶牛子宫内膜上皮细胞ROS含量的影响

2.3 PA对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响分别添加不同浓度的 PA(0.2,0.4,0.6 mmol/L)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞12 h后,如图3所示,当PA浓度为0.4 mmol/L时与对照组相比细胞凋亡率显著增加(P<0.05),当PA浓度为0.6 mmol/L时与对照组相比细胞凋亡率极显著增加(P<0.01)。

图3 不同浓度PA对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

2.4 抗氧化剂NAC对奶牛子宫内膜上皮细胞OS的影响如图4 A所示,与对照组相比,PA组的ROS含量极显著增加(P<0.01),与PA组相比PA+NAC组ROS含量显著降低(P<0.05)。如图4 B、C所示,与对照组相比PA组的SOD活力及GSH含量极显著下降(P<0.01),与PA组相比PA+NAC组SOD活力及GSH含量极显著增加(P<0.01)。如图4D所示,与对照组相比PA组的MDA含量极显著增加(P<0.01),与PA组相比PA+NAC组MDA含量显著下降(P<0.05)。

与PA组比较,#表示差异显著(P<0.05),##表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.5 抗氧化剂NAC对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响如图5所示,与对照组相比PA组的凋亡率极显著增加(P<0.01),与PA组相比PA+NAC组凋亡率极显著降低(P<0.01)。

图5 添加NAC对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

3 讨论

研究证明,体内高水平的NEFA会对动物的卵巢和子宫都具有不同程度的损伤,高浓度的NEFA可以诱导肝细胞发生OS,并且通过激活线粒体途径介导活化半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)从而造成肝细胞凋亡, NEFA中的PA可以通过激活NF-κB信号通路来诱导IL-8等炎性因子的表达和释放,由此可见PA在NEFA中是至关重要的,由此我们推测PA也可以通过OS对细胞造成损伤,细胞凋亡是一种基因控制的细胞的自主性程序性死亡方式,为了证实PA诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞发生凋亡,本试验通过CCK-8法检测了不同浓度PA刺激不同时间的奶牛子宫内膜上皮,检测其存活率并筛选最适浓度,同时采用Annexin V-FITC/PI双染法证明,当PA浓度为0.4 mmol/L时与对照组相比细胞凋亡率显著增加,当PA浓度为0.6 mmol/L时与对照组相比细胞凋亡率极显著增加,结果表明随着PA浓度的升高,细胞的凋亡率逐渐增高,呈明显的浓度依赖关系,由此可以说明PA对奶牛子宫内膜上皮细胞存在一定程度的危害。

介导细胞凋亡的途径有很多种,OS是其中非常重要的一种,奶牛在分娩前期胎盘的成熟至关重要,尽管成熟的胎盘能够启动有利的类固醇生成和花生四烯酸级联反应,但此时抗氧化防御机制的改变会干扰细胞的类固醇生成。ROS大量积聚在胎盘,可阻止胎膜的及时分离。体内过量的ROS如果未被清除,会导致严重的OS反应,ROS在RFM中是非常重要的影响因素,所以本试验通过流式细胞术检测了ROS的含量是否会随着PA浓度的变化而变化,当PA浓度为0.4 mmol/L时与对照组相比ROS含量显著增加,当PA浓度为0.6 mmol/L时与对照组相比ROS含量极显著增加。并且通过试剂盒检测了SOD、MDA、GSH等氧化抗氧化指标,结果表明PA可造成细胞的OS,并导致ROS的含量升高,对细胞造成损伤。为了验证ROS的产生是否在PA造成的细胞凋亡中起主要作用,本试验添加了抗氧化剂NAC,并用流式细胞术检测了ROS含量和细胞凋亡程度,结果表明添加了NAC后,细胞凋亡程度和ROS含量的上升明显受到缓解,表明ROS对PA造成的细胞凋亡起重要的作用,由于ROS的升高会造成炎症、内质网应激、自噬等细胞通路的激活,具体ROS是通过何种途径导致的细胞凋亡尚不清楚。综上所述,本试验表明PA是NEFA中一种非常重要的酸,对细胞具有广泛的作用,因此限制细胞内PA的水平可为酮病及胎衣不下等疾病的治疗和预防提供参考。