柠檬酸对诱导的RAW264.7细胞炎症反应的保护作用

2023-11-27骆思园刘明明黄燕华

中国兽医学报 2023年9期

骆思园,刘明明,曲庆,黄燕华,王玮

(仲恺农业工程学院动物科技学院健康养殖创新研究院,广东广州 510225)

炎症是机体对有害刺激的一种复杂的生物反应,如病原体、活性氧和某些细胞刺激物等[1]许多疾病都与炎症有关。因此,抑制过度炎症反应是治疗炎症相关疾病的首要策略[2]。在机体中的各种病理反应,如炎症反应、氧化应激等,都与脂多糖(LPS)诱导的炎症损伤有关[3-4]。LPS是阴性细菌外膜的主要成分,能有效地激活巨噬细胞和中性粒细胞产生促炎细胞因子,产生免疫炎症反应。有研究表明,LPS刺激被用来模拟炎症诱导的器官功能障碍[5]。

RAW264.7细胞为小鼠巨噬细胞,作为炎症性疾病最主要的免疫防御细胞,是调控炎症反应的中心细胞,可以释放促炎介质促进炎症因子的形成,因此在炎症的发生、维持和解决中起着关键作用。当巨噬细胞介导炎症反应时[6],主要通过抗原递呈、吞噬和产生各种细胞因子和生长因子进行免疫调节,它们主要对炎症刺激作出反应,例如细菌和各种其他化学介质。在炎症过程中,巨噬细胞被这些细胞因子和刺激的识别激活了下游细胞内信号级联,随后释放各种促炎物质[7]。

柠檬酸(CA)被认为是具有抗菌活性的弱酸[8],CA可降低胃肠道内微生物的生长,提高饲料利用率[9],同时对肠道黏膜生长有促进作用[10]。CA可调节胃肠道pH,改善消化道菌群结构,为乳酸菌等有益菌的生长繁殖创造最佳条件;同时,CA还可以激活宿主的免疫系统,诱导宿主细胞产生具有杀菌作用的抗菌肽,从而维持动物机体胃肠道内的微生物菌群平衡[11]。CA是动物机体三羧酸循坏的重要中间产物,是糖、蛋白质和脂肪代谢的一个必经过程,为生命活动提供能量[12]。另外有研究表明,饲粮中添加植物精油和复合物使肉鸡免疫器官中TLR4转录受到抑制并将其信号向核因子转导,抑制了炎症信号通路的激活,进而使下游促炎因子释放较少,缓解机体炎症[13]。

本试验以LPS诱导建立炎症模型,通过研究不同浓度CA(1,2,3,4 mmol/L)对LPS诱导的RAW264.7细胞的影响,为治疗RAW264.7细胞炎症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系和细胞培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7购自北京北纳生物科技有限公司。细胞在添加10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养基中生长,置于37℃、饱和湿度、95%空气+5%CO2的培养箱中培养。

1.2 RAW264.7细胞处理对照组用含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养;LPS组为1 mg/L LPS处理24 h;CA组为4 mmol/L CA处理24 h;CA预处理组(CA+LPS组)为4 mmol/L CA预保护1 h后,用1 mg/L LPS处理24 h。

1.4 主要仪器CO2细胞培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、多功能酶标仪均购自Thermo公司;4℃冰箱购自海尔公司;化学发光成像仪、湿转仪、电泳凝胶玻璃板、电泳电泳槽和梳子、蛋白电泳仪均购自伯乐Bio-Rad公司。

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1.3 主要试剂反转录酶购自TaKaRa公司;RNAiso Plus购自于赛默飞公司;荧光定量PCR试剂盒购自于瑞士Roche公司;胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、胰酶购自于Gibco公司;无血清细胞冻存液购于新赛美生物科技公司;BCA蛋白定量试剂盒购于Thermo公司;BSA及脱脂奶粉购于宝泰克公司;PVDF膜购于Merck Millipore公司;ECL超敏发光液购于北京普利莱公司;细胞培养瓶、细胞冻存管、15 mL/50mL离心管、6 cm细胞培养皿均购自Corning公司。

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2.1 不同浓度CA对RAW264.7细胞活力的影响与对照组相比,0.5 mmol/L CA对RAW264.7细胞活力没有明显的影响,5,10,20,40 mmol/L CA可不同程度地降低RAW264.7细胞活力;因此,在1,2,3,4 mmol/L浓度范围内选定浓度4 mmol/L CA进行后续试验(图1)。

1.6 组织RNA的提取收集处理后的细胞加入1 mL TRIzol,于室温放置10 min,使其充分裂解,并将液体转移至1.5 mL离心管中。按照200 μL 氯仿/mL TRIzol,加入200 μL氯仿,剧烈振荡15 s,室温放置10 min,于4℃ 12 000 r/min离心10 min。取出,室温放置约2 min,等待白色沉淀出现后,吸取上清水相,移入另一离心管中,按500 μL异丙醇/mL TRIzol,加入500 μL异丙醇,盖上离心管盖,并上下颠倒10次,20℃过夜。第2天取出放4℃静置15 min后,4℃ 12 000 r/min离心10 min,弃上清液,此时管底的沉淀即为RNA。加入75%乙醇1 mL,平拿离心管,将乙醇吸出。再次加入75%乙醇1 mL,转几圈后将乙醇移除。RNA由白色渐渐变成透明状态,等沉淀几乎透明后,加入20 μL的DEPC水,振荡至沉淀溶解后测定RNA浓度。

1.7 实时荧光定量PCR检测炎症相关因子mRNA的表达收集处理过的细胞提取RNA,并反转录为cDNA,然后做相对荧光定量PCR,检测细胞中炎症相关因子的mRNA表达量。采用实时荧光定量PCR法检测LPS诱导前后肠道炎性因子的表达水平变化。将得到的RNA反转录成cDNA后,按荧光染料10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 8 μL,总体系20 μL加样,每组3个重复,混匀后离心,进行荧光定量检测。参考已报道的序列[14]合成TNF-α、IL-1β、IL-6的引物,引物信息如表1。

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1.5 细胞增殖能力检测将RAW264.7细胞离心,以2×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中,每个处理组重复5次。在细胞接种24 h后,将培养基改为DMEM基础培养基。处理4 h后,加入CA(1,2,3,4 mmol/L)进行预保护,2 h后加入LPS(1,2,3,4 mg/L)进行刺激。刺激24 h后,弃用培养基,每孔中加入100 μL CCK8预混料溶液,1 h后检测。

表1 引物序列及扩增产物长度

1.8 蛋白提取及Western blot检测炎症相关通路蛋白的表达分别收集各处理组细胞,加入蛋白裂解液提取总蛋白,使用BCA试剂盒确定蛋白质浓度,根据测得浓度将样品浓度调至一致。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质样品,然后转移至PVDF膜上并在含有5%脱脂牛奶封闭液中封闭1 h。4℃环境下孵育一抗过夜,TBST洗涤液洗涤后室温孵育二抗1 h,洗涤后进行显影。

2.4 CA对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的保护作用与对照组相比,在1 mg/L LPS处理使RAW264.7细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA的表达显著升高。与LPS组相比,LPS+CA组的IL-6(图4A)、TNF-α(图4B)和IL-1β(图4C)的mRNA表达明显降低。以上结果表明,4 mmol/L CA处理可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的过度产生。RAW264.7细胞中单独添加4 mmol/L CA也可降低炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达。

2.3 不同浓度CA对RAW264.7细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表达的影响与对照组相比,在2,3,4 mmol/L CA处理均可不同程度地降低细胞中IL-6(图3A)、TNF-α(图3B)、IL-1β的mRNA表达量(图3C)。有趣的是,1 mmol/L CA处理RAW264.7细胞后,TNF-α mRNA的表达量显著上升(图3B)。