CPR和P450基因在昆虫抗药性中的作用研究进展

乔宪凤,王 康,彭 雄,张晓赫,陈茂华*

(1.西北农林科技大学图书馆,陕西杨凌 712100;2.西北农林科技大学植保学院/作物抗逆与高效生产全国重点实验,陕西杨凌 712100)

细胞色素P450酶系是一种非常重要的氧化酶系,其主要包括细胞色素P450(Cytochrome P450,P450)、CPR(Cytochrome P450 reductase,CPR)、细胞色素b5(Cytochrome b5)、NADH-细胞色素b5还原酶(Nicotinamide adenine dinucleotide-cytochrome b5 reductase)以及磷脂(Phospholipid)等,其中细胞色素P450和CPR在该酶系起中心作用。细胞色素P450酶系广泛存在于自然界所有需氧有机体中,其在生物个体代谢内源化合物(如类固醇、脂肪酸和激素等)和外源化合物(如农药、药物、环境污染物、植物毒素等)中起重要作用(Pandey and Fluck,2013)。

作为细胞色素P450酶系的核心组成部分,CPR与P450形成一个电子传递链,CPR将电子传递给P450后,P450才能与农药等化合物发生氧化还原反应。昆虫和其他动物P450基因是一个超大基因家族,包含多个P450基因,这些P450可分为微粒体型和线粒体型P450,但是真核生物代谢外源物质的P450主要是依赖于CPR的微粒体P450。动物体内只有一个CPR,因为CPR是P450唯一的电子供体,所以这个单一的CPR必然与多种不同的P450相互作用,因此,CPR在P450活性反应及代谢化合物中起到限速因子的作用,即单一的CPR控制所有的P450的代谢速度与代谢能力,CPR的突变会显著影响P450的代谢能力(Pandey and Fluck,2013)。大量的研究表明,CPR基因突变是影响人类P450代谢药物和环境有毒物质的重要因素(Liangetal.,2017),CPR基因突变及遗传多态性对人类药物代谢的影响相关研究非常深入(Agrawaletal.,2008;Hartetal.,2008;Huangetal.,2008;Liangetal.,2017),然而,有关CPR基因突变影响害虫对农药的代谢抗性的研究较为薄弱。本文总结了P450基因高表达介导昆虫对杀虫剂抗性的调控机制、P450基因介导的昆虫抗药性进化可塑性、CPR基因在害虫抗药性中的作用、CPR基因遗传多态性对P450代谢能力的影响,旨在为深入研究害虫抗药性机制和进行害虫抗药性治理提供依据。

1 P450基因高表达介导昆虫对杀虫剂抗性的调控机制

大量研究显示,P450基因的过量表达导致昆虫对不同农药产生高水平的代谢抗性。引起抗药性昆虫P450基因过量表达的原因可能有P450基因的编码区突变、顺式作用元件和反式作用因子变化、基因扩增等等(Lietal.,2007;Zimmeretal.,2018)。

P450基因启动子区的变异(即启动子区顺式作用突变,Cis-acting mutation)介导的昆虫抗药性在昆虫中有较多报道。在卫生害虫的研究中发现,CYP6D1的超高表达是导致家蝇Muscadomestica对拟除虫菊酯类农药产生抗药性的重要原因,采自美国的LRR家蝇抗性品系的CYP6D1启动子区存在一个15 bp的插入,该插入片段和家蝇对拟除虫菊酯的抗性相关(Seifertetal.,2002),而采自中国的家蝇拟除虫菊酯抗性个体中并非都包含这个15 bp插入片段,分析认为,来自不同地区的家蝇中包含15 bp启动子插入的CYP6D1基因具有单一起源(Single origin)特性(Panetal.,2018)。CYP6G1的过量表达导致拟果蝇Drosophilasimulans对DDT的高水平抗性,但抗性拟果蝇CYP6G1启动子区插入的是Doc转座子(Schlenkeetal.,2004)。CYP6G1的过量表达也是黑腹果蝇Drosophilamelanogaster对DDT产生高水平抗性的主要原因,抗性种群CYP6G1基因的启动子区插入了一个Accord转座子,该转座子插入是介导CYP6G1在抗性种群中过量表达的重要因子(Chungetal.,2007),有些种群的抗性个体CYP6G1基因还有P因子和HMS-Beagle两种转座子插入,这些转座子插入也可能在抗性的黑腹果蝇CYP6G1的过量表达起调控作用(Schmidtetal.,2010)。致倦库蚊CulexquinquefasciatusJPal-per抗性品系对氯菊酯(Permethrin)等拟除虫菊酯类农药产生极高水平抗性,CYP9M10基因的过量表达是抗性产生的重要原因,而抗性个体中CYP9M10基因启动子区的CuRE1转座子插入和其他顺式作用突变是导致该基因过量表达的重要原因(Itokawaetal.,2010)。

P450介导的农业害虫抗药性的顺式调控机制近年来也有报道。桃蚜MyzuspersicaeCYP6CY3启动子区一个(AC)n重复微卫星能调控该基因表达,从而影响CYP6CY3对烟碱和新烟碱类农药的代谢(Bassetal.,2013)。Pangetal.(2014)研究还发现,褐飞虱NilaparvatalugensCYP6AY1基因启动子区存在丰富的多态性,这些多态性位点与CYP6AY1介导的褐飞虱对吡虫啉和噻嗪酮高水平抗性相关。CYP6ER1基因的高表达导致褐飞虱对吡虫啉(Imidacloprid)的高水平抗性(Pangetal.,2016),Liangetal.(2018)研究发现,褐飞虱CYP6ER1基因一个选择性剪接体A2的启动子区存在多态性,抗性个体中的4个SNPs提高了该基因的启动子活性,并且可能调控该基因的表达水平。CYP6B7基因在棉铃虫Helicoverpaarmigera对拟除虫菊酯农药的代谢抗性中发挥作用,该基因能够被外源化合物诱导表达,Xuetal.(2018)分析了调控CYP6B7启动子区调控该基因表达的顺式作用因子,这些因子的变化影响CYP6B7的表达水平,并可能与棉铃虫的抗药性及外源物质代谢的相关。Lietal.(2018)研究发现,CYP6BG1的上调表达与小菜蛾Plutellaxylostella对氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)的抗性相关,通过对抗性品系和敏感品系的比较分析显示,该虫CYP6BG1基因启动子区存在多态性,启动子变异的顺式调控影响了该基因的表达水平(Lietal.,2019)。

反式作用因子调控昆虫P450表达,进而导致昆虫高水平代谢抗性的报道较少。拟除虫菊酯抗性品系的家蝇CYP6D1基因的表达除了受顺式因子调控外,也可能受反式作用因子的影响(Liuetal.,1998;Scottetal.,1999)。最新的研究显示,转录因子CncC/Maf能够调控P450基因的表达,导致马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata、斜纹夜蛾Spodopteralitura、甜菜夜蛾Spodopteraexigua等害虫分别对不同农药的抗性(Gaddelapatietal.,2018;Huetal.,2020;Luetal.,2020)。除了启动子区的顺式作用调控外,转录因子FTZ-F1的反式调控作用也影响小菜蛾CYP6BG1基因表达,二者共同介导该虫对氯虫苯甲酰胺的抗性(Lietal.,2019)。转录因子CREB(cAMP-response element binding protein)能够直接被蛋白激酶基因MAPK(Mitogen-activated protein kinase)激活,从而介导P450CYP6CM1基因的高表达,导致烟粉虱Bemisiatabaci对新烟碱类农药的抗性(Yangetal.,2020)。

piRNA(Piwi-interacting RNA)或miRNA(microRNA)介导的抗药性相关基因转录后调控也有报道,靶向抗药性相关基因的piRNA或miRNA负调控这些基因的表达(Yeetal.,2017)。piRNA-3878靶向CYP307B1基因,影响淡色库蚊Culexpipienspallens对溴氰菊酯的抗性(Yeetal.,2017)。有研究发现,miR-2b-3p和miR-14b-5p在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性发展具有重要作用,注射miR-2b-3p和miR-14b-5p 模拟物能显著抑制CYP9F2和CYP307a1基因的表达水平,食物中添加miR-2b-3p模拟物能显著提高抗性小菜蛾幼虫经溴氰菊酯处理后的死亡率(Etebarietal.,2018)。在果蝇的抗DDT种群中,CYP6G1和CYP6G2基因高水平表达,miR-310s能和这两个P450基因3′-UTR结合并调控这两个基因的表达(Seongetal.,2020)。miR-285靶向淡色库蚊CYP6N23基因,通过调控该基因的表达水平影响淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性,RNAi干扰CYP6N23以及注射miR-285L模拟物后,该基因的表达水平显著降低且该虫对溴氰菊酯敏感性上升(Tianetal.,2016)。

P450编码区的变异导致昆虫抗药性的报道较少,在牧草盲蝽Lyguspratensis抗苄氯菊酯的品系中,CYP6X1编码区存在大量的核苷酸变异,但是这些变异与抗药性的关系有待进一步研究(Zhuetal.,2003)。在褐飞虱的吡虫啉抗性品系中,CYP6ER1编码区也发现突变,这些突变是导致褐飞虱对吡虫啉的抗性的重要原因(Zimmeretal.,2018)。研究发现,棉铃虫拟除虫菊酯抗性品系中,存在一个由CYP337B1和CYP337B2嵌合而成的新的CYP337B3基因,嵌合基因CYP337B3的出现可能是导致棉铃虫对氰戊菊酯(Fenvalerate)和氯氰菊酯(Cypermethrin)等拟除虫菊酯农药产生抗性的重要原因,不同棉铃虫地理种群CYP337B3基因存在差异,这种嵌合P450基因可能是P450介导害虫抗性的一种新机制(Duriganetal.,2017;Choietal.,2018)。除了上述机制之外,P450基因扩增(Gene duplication)导致的高水平代谢抗性在桃蚜和褐飞虱等昆虫中有报道,桃蚜和褐飞虱通过P450基因拷贝数的增加来产生对吡虫啉等新烟碱类农药的高水平抗性(Puineanetal.,2010;Zimmeretal.,2018)。

2 P450基因介导的昆虫抗药性进化可塑性

同种昆虫不同种群对相同的农药产生抗药性时,导致抗性产生的P450基因不同,而且多个P450基因在不同种群中存在显著不同的上调表达;同一昆虫品系在某种农药的抗性选择压力下,影响抗性的P450基因的种类和表达特性,会随着持续的农药选择而发生变化;同种昆虫的不同品系对某种农药产生相似的抗性倍数时,不同P450基因的过量表达水平存在明显差异;这些现象被称为细胞色素P450介导抗药性的进化可塑性(Evolution plasticity)(Scott and Kasai,2004;Festucci-Busellietal.,2005;邱星辉等,2008;Gaoetal.,2012)。Scott and Kasai(2004)分析指出,影响P450基因过量表达的调控因子的差异,可能是造成其介导的抗性可塑性的重要原因之一。

Scott and Kasai(2004)研究显示,采自美国的不同家蝇抗苄氯菊酯品系中,介导抗性产生的P450基因明显不同,在LPR抗性品系中,位于染色体1和染色体2的CYP6D1过量表达是抗性产生的主要原因,但CYP6D1在YPER抗性品系中表达量上调不明显,而且YPER抗性品系的染色体上不存在CYP6D1基因位点,分析认为,LPR品系和YPER品系通过不同的P450基因的变化来介导其对抗苄氯菊酯的抗性。Gaoetal.(2012)对6个采自中国的抗性家蝇苄氯菊酯抗性品系的比较研究表明,8个P450基因(CYP6A5v1、CYP6A5v2、CYP6A36、CYP6A40、CYP6D1、CYP6D3、CYP6D8和CYP6G4)在6个不同品系中具有明显不同的上调表达特性;在抗性倍数相似的品系中,P450基因过量表达特点亦不同;而抗性倍数差别较大的品系中,某些P450基因上调表达的倍数却相似,该研究组认为,P450基因的进化可塑性介导了这些家蝇种群对拟苄氯菊酯的抗性,在各品系上调表达的P450基因中,CYP6G4和CYP6D1起主导作用。

在黑腹果蝇相关研究中,CYP6A2、CYP6A8、CYP4E2、CYP6G1、CYP6G1和CYP612D1在不同DDT抗性品系中具有不同过量表达特性(Festucci-Busellietal.,2005),其中CYP6G1过量表达是介导黑腹果蝇DDT的主要因子,而且该基因过量表达导致的DDT抗性在世界各地不同种群中广泛存在(Schmidtetal.,2010;Morraetal.,2010),然而,过量表达CYP6G1的黑腹果蝇田间品系在实验室DDT的选择压力下,其CYP12D1和CYP6A2的表达量显著上调,而将CYP6G1敲除后,在实验室相同的DDT选择压力下,CYP6A8表达量显著上调(Le Goffetal.,2003),可见,在DDT的选择压力下,黑腹果蝇对的P450基因具有复杂的进化可塑性。

在灰飞虱Laodelphaxstriatellus溴氰菊酯抗性品系中,4个P450基因(CYP353D1v2、CYP6FU1、CYP6AY3v2和CYP439A1v3)过量表达,而且不同基因过量表达的水平不同,体外表达的CYP6FU1和CYP6AY3v2皆能代谢溴氰菊酯(Mianetal.,2019)。在世界不同地方,褐飞虱的田间种群都通过CYP6ER1的过量表达产生对吡虫啉的高水平抗性(Zimmeretal.,2018),但是不同地理种群CYP6ER1可变性剪接体不同,且CYP6ER1过量表达的调控机制存在差异,采自泰国、越南、印度尼西亚和印度的田间种群发现CYP6ER1在抗性个体中发生编码区突变,且具有这些突变的CYP6ER1可变性剪接体拷贝数是敏感个体的2倍(Zimmeretal.,2018);采自中国的褐飞虱吡虫啉抗性品系在CYP6ER1启动子区存在大量SNPs,这些SNPs影响CYP6ER1启动子活性(Pangetal.,2014),由此可见,不同的褐飞虱地理种群通过同一个P450基因的高表达产生对吡虫啉产生抗性,但是存在不同的调控机制。与同一个敏感品系相比,在棉蚜的噻虫嗪抗性品系中,CYP6CY14、CYP6DC1、CYP6CZ1、CYP6DD1、CYP6CY9、CYP6CY13-2、CYP6CY5、CYP6CY18、CYP6CY12等9个P450基因表达量显著上调,而桃蚜的螺虫乙酯(spirotetramat)抗性品系中CYP6CY14、CYP6CY4、CYP6DC1、CYP6CY18等4个基因表达量显著提高,两个不同抗性品系中有3个相同的P450基因都上调表达,但是上调表达的模式明显不同(Schlenkeetal.,2004;Wuetal.,2018)。

3 CPR的基本结构和功能

细胞色素P450可分为微粒体型和线粒体型, 真核生物代谢外源物质的P450主要是依赖于CPR的微粒体P450(以下简称P450),所有微粒体型P450均需要依靠CPR获得电子进而产生催化活性(Pandey and Fluck,2013;Feyereisen,2015)。CPR和P450皆属于膜结合蛋白,锚定于细胞内质网膜上。CPR存在两个功能区域,即N端疏水膜结合区和C端亲水催化活性区。N端疏水膜结合区锚定在生物膜上,其作用是维持正确的蛋白空间构象,保证细胞色素P450还原酶与细胞色素P450之间的电子传递能够顺利进行。C端亲水催化活性区是细胞色素P450还原酶发挥催化活性的主要部分,起电子传递作用。催化活性区包含三个结构域,分别为FMN(黄素单核苷酸,Flavin mononucleotide)结合域、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸,Flavin adenine dinucleotide)和NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)结合域,FMN与FAD之间的连接域则保证两个结合域之间空间定位一致,保证电子传递的畅通。CPR从NADPH处获得电子,经FAD传递给FMN并将FMN还原,还原性FMN将电子传递给P450的血红素(Heme)结合位点,从而还原P450且激活分子氧,进而引起底物的羟化反应。

不同动物的CPR蛋白大小存在一定差异,一般大小约为80 kDa,大约680个氨基酸组成(Pandey and Fluck,2013),例如,禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi的CPR基因DNA全长16 000 bp,含有14个外显子,ORF(开放阅读框)全长2 046 bp,编码681个氨基酸,大小为77.11 kDa(Wangetal.,2016)。

4 CPR基因在害虫抗药性中的作用

CPR变异介导昆虫的抗药性是一种新的抗药性机制,目前昆虫CPR与农药代谢和抗药性关系的研究较少。CPR与抗药性相关在几种昆虫中已有报道,但是具体机制还缺乏研究。人CPR遗传多态性影响P450对药物代谢的相关研究广泛而深入(Hartetal.,2008;Liangetal.,2017),这对昆虫CPR介导抗药性的机制研究具有很好的借鉴作用。

有研究发现,微小按蚊AnophelesminimusCPR的L86和L219两个位点在其与FMN结合中具有重要作用,体外定点突变L86F和L219F能提高微小按蚊CPR的FMN结合能力和CYP6AA3对溴氰菊酯的代谢能力,突变的CPR酶与FAD结合力较弱。进一步地定点突变分析显示,L86F/L219F/C427R三突变可以较好结合FAD,而L86F/L219F/W678R和L86F/L219F/W678R三突变的CPP酶对FAD的结合能力没有影响,说明不同的氨基酸位点在底物结合中的作用不同(Sarapusitetal.,2010;Sarapusitetal.,2013)。通过冈比亚按蚊Anophelesgambiae的CPR进行体外表达和生化特性分析发现,冈比亚按蚊的CPR和人的CPR对小分子化合物有不同的结合特性,分析认为,CPR可以作为开发安全农药的潜在靶标(Lianetal.,2011)。注射CPR dsRNA可以显著增加臭虫Cimexlectularius抗性品系对溴氰菊酯的敏感性,但是对敏感品系的影响不显著(Zhuetal.,2012);饲喂CPR dsRNA可以显著提高灰飞虱抗性品系对噻嗪酮的敏感性,但是对敏感品系无显著影响,说明CPR在臭虫和灰飞虱的抗药性中发挥作用(Zhangetal.,2016)。Huangetal.(2015)研究发现,CPR基因在橘小实蝇Bactroceradorsalis马拉硫磷(Malathion)抗性品系和敏感品系中表达水平相似,在注射CPR dsRNA后显著提高成虫对马拉硫磷的敏感性。朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus的CPR在甲氰菊酯抗性品系中显著上调表达,饲喂CPR dsRNA可显著降低朱砂叶螨P450总酶活力,且显著提高抗性品系对甲氰菊酯的敏感性,而对敏感品系没有显著影响(Shietal.,2015)。注射CPR dsRNA后,可以显著提高冈比亚按蚊、棉铃虫、飞蝗Locustamigratoria、柑橘蚜Toxopteracitricidus、柑橘木虱Diaphorinacitri、二斑叶螨Tetranychusurticae等对农药的敏感性(Lycettetal.,2006;Tangetal.,2012;Zhangetal.,2017;Jingetal.,2018;Adesanyaetal.,2020;Yuanetal.,2021)。

5 CPR基因遗传多态性对P450代谢能力的影响

在环境的选择压力下,同一群体一些个体在某些基因位点会产生突变,如果某个位点突变在群体中超过1%,就称为遗传多态性(Genetic polymorphisms)(Hedrick,2011)。CPR在人体中与类固醇和药物代谢关系紧密,CPR遗传多态性显著影响人的药物代谢,不同种族的人群具有不同的CPR遗传多态性,因此不同种族人群对相同药物的代谢能力不同,其原因是这些CPR遗传多态性影响了P450的代谢能力,相关研究对指导药物种类和剂量的选择具有重要意义。

同一个CPR突变对不同的P450代谢能力的影响不同,其影响作用甚至相反;不同的CPR突变对同一个P450代谢能力的影响也不同。Huangetal.(2008)研究发现,842个健康美国人的CPR在32个位点存在氨基酸多态性,CPR的A503V突变在美国华人中的突变率为36.7%,而在美国非洲裔中的突变率只有19.1%;对这32个突变位点进一步的体外表达分析发现,不同突变位点对两个P450基因CYP1A2和CYP2C19代谢能力的影响不同;A287P和R457H突变皆使CYP1A2和CYP2C19失去代谢能力;与野生型CPR相比,CPR的A503V突变使CYP1A2活力降低15%,但使CYP2C19代谢能力提高13%(Huangetal.,2008);而Q153R突变的CPR使CYP1A2和CYP2C19活力分别提高到野生型的144%和284%;Q153R、G213E、P452L、A503V、G504R突变对CYP1A2和CYP2C19活力影响差异极显著(Agrawaletal.,2008)。另外研究则发现,人CPR基因的A287P突变使CYP17A2的活性降低80%(Huangetal.,2005),A287P突变使CYP21A2的活力降低24%(Dhiretal.,2007),A503V突变显著提高了CYP2C9.1、CYP2C9.2和CYP2C9.3的代谢能力(Subramanianetal.,2012),因此,同一个CPR多态性位点对不同的P450活力影响不同,特定的CPR突变对某个P450基因代谢能力的影响必须用这个P450基因做具体分析,不能用其他的P450基因代替(Agrawaletal.,2008;Subramanianetal.,2012)。

CPR遗传多态性和突变对P450活力影响的机制也不相同。人的CPR基因R457H、Y459H和V492E突变位于其FAD结合域,因而影响了CPP与FAD的结合,从而导致CYP17A1和CYP19A1两个P450完全失去代谢能力(Kranendonketal.,2008;Pandey and Fluck,2013);而CPR的Q153R、M263V突变靠近其FMN结合域,因而使CPR的细胞色素c的还原活性降低40%～90%(Huangetal.,2005);G539R突变位于CPR的NADPH结合域,使CPR的细胞色素c的还原活性降低91%(Huangetal.,2005)。A287P位于FMN与FAD之间的连接域,该CPR突变的影响因P450代谢底物的不同而不同,例如,其显著影响CYP17A1代谢17,20碳链裂解酶(17,20 lyase)的活性,对CYP17A1代谢17α-羟化酶的影响较小(17α-hydroxylase),对CYP19A1和CYP21的底物代谢能力没有影响(Dhiretal.,2007)。

此外,CPR的突变可以导致一种人类常染色体隐性遗传病,即P450还原酶缺陷症(P450 oxidoreductase deficiency),该疾病的原因是CPR基因突变影响了人体某些P450(CYP17和CYP21)对类固醇的代谢能力,而这些P450基因本身并没有发生变化,目前已经报道了CPR的A287P、R457H、V492E、C569Y和V608F等约20个突变位点能引起P450还原酶缺陷症,且不同种族患者的CPR突变和遗传多样特征不同(Hartetal.,2008;Liangetal.,2017)。由于CPR的突变与人类药物代谢及P450功能缺陷疾病密切相关,很多CPR突变已经成为分子标记,用于评判不同种族人群对药物的代谢能力及P450还原酶缺陷症的发病可能性(Hartetal.,2008)。

如上所述,抗药性昆虫CPR的表达量的变化及其CPR编码区突变在多种昆虫中报道,但是CRP影响昆虫抗药性的机制亟待阐明,在下一步的研究中,可以借鉴人和高等动物中相关的研究成果,深入阐述这一害虫抗药性新机制。

6 总结与展望

害虫抗药性机制非常复杂,常见的抗性类型有行为抗性、表皮穿透性降低、代谢抗性与靶标抗性等,但害虫抗药性机理远未阐明,随着相关研究的深入,抗药性新机制不断被发现。P450酶系介导的昆虫代谢抗性是昆虫抗药性的最重要类型,一直受到广泛的关注。目前关于P450酶系在害虫抗药性中的研究主要集中在P450基因的表达调控机制和P450基因表达量的变化等方面。虽然CPR基因与害虫抗药性相关在多种昆虫已经发现,但是其具体机制尚待深入阐明。深入研究CPR基因变异对P450介导的害虫抗药性的影响,不仅可以阐明P450酶系介导昆虫抗药性的新机制,而且对于建立基于CPR突变的抗性监测和抗性预警的分子标记以及害虫抗药性治理具有重要意义。