半翅目昆虫卵黄原蛋白及其合成调控的研究进展

盘碧琼,黎海霖,徐 淑,郑霞林,陆 温,王小云*

(1. 广西大学农学院,广西农业环境与农产品安全重点实验室,南宁 530004;2. 广东省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省植物保护新技术重点实验室,广州 510640)

卵黄发生(Vitellogenesis)是卵生动物性成熟时卵黄产生的过程,是繁殖所必需的生理活动。在卵黄发生时期,沉积在卵内且为发育中的卵母细胞直接提供营养性及功能性物质的蛋白被称为卵黄蛋白(Yolk protein, Yp)或卵黄磷蛋白(Vitellin, Vn)(Tufailetal., 2008)。在昆虫生殖发育过程中,卵母细胞积累大量的卵黄蛋白,以确保给胚胎提供足够的核酸、蛋白质、脂质、磷酸盐、碳水化合物等营养物质(Tufailetal., 2009)。而卵黄原蛋白(Vitellogenin, Vg)是卵黄蛋白的前体物质,一类大分子量的糖脂复合蛋白,广泛存在于卵生脊椎动物和非脊椎动物的血淋巴、肝脏(脂肪体)和卵中(严盈等,2010)。昆虫Vg除在生殖发育起重要调控作用外,还能够作为载体传播病毒、参与各种形式的免疫应答反应等多种功能(李佳鹏等,2022)。半翅目Hemiptera隶属于节肢动物门昆虫纲,由异翅亚目、胸喙亚目、头喙亚目和鞘喙亚目组成,是昆虫纲中最大的非完全变态的目(Lietal., 2017)。半翅目昆虫体积小、繁殖能力强、种群数量大、寄主范围广,以刺吸式口器吸食果树、蔬菜等农作物的嫩芽、嫩枝、叶、花蕾、花、果实等的汁液,造成植物组织坏死、严重影响作物的产量和质量,是重要的农林害虫类群之一,如蚜虫Aphidoidea、粉虱Aleyrodidae等(Foreroetal., 2008;Tsuchidaetal., 2010;王颖颖等,2014)。此外,半翅目害虫的取食方式使其极易成为植物病原体的传播介体,加重其为害(章攀等,2019)。例如,柑橘木虱Diaphorinacitri传播的韧皮部杆菌亚洲种CandidatusLiberibacter asiaticus,能引起柑橘黄龙病,对柑橘产业极具破坏性(Djeddouretal., 2021);灰飞虱Laodelphaxstriatellus、白背飞虱Sogatellafurcifera分别传播的水稻条纹叶枯病病毒(Rice stipe virus, RSV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV),均对水稻生产造成严重危害(Nemotoetal., 1994;周国辉等,2010)。基于半翅目昆虫产卵量大、繁殖速度快的特点,从减少产卵、阻碍病原传播作为防治切入点可以达到降低害虫种群数量、遏制继发病害的效果。因此,明确重要产卵相关基因Vg及其调控机制,可为半翅目昆虫防控的提供新思路,对有效减少农林业损失有重要意义。

1 半翅目昆虫的卵黄原蛋白

1.1 半翅目昆虫卵黄原蛋白的合成

1.1.1合成方式

Vg合成的主要方式为外源性卵黄合成(Heterosynthesis),即由卵母细胞以外的器官或组织合成Vg,随之Vg被分泌到循环系统中并被运输到卵巢组织,发育中的卵母细胞通过受体传递介导的胞吞作用将Vg摄取,最后在卵母细胞中被吸收、裂解,形成卵黄蛋白,并以卵黄颗粒或球状物的形式储存在卵细胞质中(李兆杰等,2010)。Vg还有另一合成方式为内源性卵黄合成或自动合成(Autosynthesis),即由卵母细胞自身的内质网、高尔基体、线粒体等细胞器上直接合成,可从形态学上观察到合成过程(Bilinski, 1976;张士璀等,2002)。大多数昆虫的Vg合成方式都为外源性合成,甚至在最原始的无翅亚纲昆虫中也发现有外源合成卵黄发生(Raikheletal., 1992)。内源性合成在软体动物、环节动物、节肢动物甲壳类等发生较常见,在昆虫内只发现在巨型跳虫Tetrodontophorabielanensis(Waga)和AcerentomongallicumJonescu (Protura)两种无翅亚纲昆虫的超微结构观察表明卵黄发生有自合成(Bilinski, 1976;Klag, 1978)。

1.1.2合成场所

昆虫中,主要由卵巢外组织—脂肪体合成Vg并分泌到血淋巴中,然后由卵母细胞摄取转化为卵黄蛋白存储,为胚胎发育提供物质和能量(Postlethwaitetal., 1985;Raikheletal., 1992)。例如,印度谷蛾Plodiainterpunctella(Shirketal., 1984)、美洲蜚蠊Periplanetamericana、埃及伊蚊Aedesaegypti、刻克罗普斯蚕蛾Hyalophoracecropia(Panetal., 1969)、飞蝗Locustamigrataria(Engelmann, 1979)等。目前,只在一些高等双翅目和鞘翅目昆虫中发现卵巢具有合成Vg的能力。例如,果蝇Drosophila的卵巢和脂肪体一样能产生Vg(Bownes, 1982);加勒比按实蝇Anastrephasuspensa的Vg多来源于卵巢,少量来自血淋巴细胞(Handleretal., 1988);而厩螫蝇Stomoxyscalcitrans的卵巢是Vg的唯一来源(Jonetal., 1986)。这可能是由于蝇类的Vg较为特殊,与哺乳动物的三酰基甘油脂酶的氨基酸序列相似(Hagedorn and Kunkel, 1979)。此外,某些鞘翅目昆虫的卵巢和脂肪体都有合成Vg的能力,如马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Peferoen and Loof, 1986)、七星瓢虫Coccinellaseptempunctata(Zhaietal., 1984)等。对于半翅目昆虫,Tufail等(2010)通过Northern杂交法检测Vg在褐飞虱Nilaparvatalugens不同性别、组织和阶段特异表达,结果只在褐飞虱雌虫脂肪体中检测到Vg。相同结果在骚扰锥蝽Triatomainfestans、绿盲蝽Apolyguslucorum和臭虫Cimexlectularius中也有报道(Blarizaetal., 2014; Lietal., 2016; Moriyamaetal., 2016)。因此,半翅目昆虫Vg的合成场所主要在脂肪体。

1.2 半翅目昆虫卵黄原蛋白的结构

昆虫脂肪体内合成的Vg分子量约为200 kDa,等电点为6.1～6.3,其单体可由1～4个亚基构成(Paterakietal., 2000)。根据昆虫中的Vg前体是否被转化酶水解或分解后亚基组成和分子量大小可将昆虫分为3种类型(戈林泉和吴进才,2010)。第一类转化酶将Vg前体酶切成一个分子量大于180 kDa的大亚基和分子量小于50 kDa的小亚基,多数昆虫为此类,如飞蝗(Chenetal., 1979)、德国小蠊Blattellagermanica(Comasetal., 2000)等。第二类Vg前体没有被转化酶水解,Vg基因中编码小亚基的部分没有表达活性,编码大亚基的部分具有表达活性,故只有一个大分子量的亚基,一般为膜翅目昆虫,如意大利蜜蜂Apismellifera(Piulachsetal., 2003)、低等的双翅目,如埃及伊蚊(Chenetal., 1994)及少数鳞翅目昆虫,如柞蚕Anteraeapernyi(Liuetal., 2001)。第三类Vg前体被酶解为几个分子量约为80～110 kDa的多肽,主要包括不完全变态昆虫,如半翅目的棒蜂缘蝽Riptortusclavatus等(戈林泉和吴进才,2010)。

半翅目昆虫的卵黄蛋白亚基数目差异大。在刺肩蝽Podisusmaculiventris,只有一个蛋白亚基,重量为171 kDa(Shapiroetal., 2000);始红蝽Pyrrhocorisapterus有两个蛋白亚基,重量分别为185 kDa和150 kDa(Sochaetal., 1991);短箭痕腺长蝽Spilostethuspandurus有3个蛋白亚基,重量分别为176、166和156 kDa(Ibezetal., 1992);长红锥蝽Rhodniusprolixus有4个蛋白亚基,重量分别为180、158、44、38 kDa(Masudaetal., 1985);点蜂缘蝽象RiptortusclavatusVg1有7个蛋白亚基,分别为210、160、120、105、82、63和54 kDa,Vg2有5个蛋白亚基,分别为170、120、105、72和50 kDa(Shinodaetal., 1996);二点益蝽Perillusbioculatus有3个卵黄蛋白亚基,重量分别为177、84和59 kDa(Adamsetal., 2002)。

1.3 半翅目昆虫卵黄原蛋白的非蛋黄前体效应

在半翅目昆虫中,Vg除了传统的蛋黄前体功能,还与昆虫免疫反应、植物防御、病毒传播等有关,对其生理发育及环境适应性有很大影响。近年来,半翅目昆虫Vg被证实可以提高其自身免疫反应、降低寄主植物的防御功能。马铃薯木虱Bactericeracockerelli的Vg1-like是一种传统的Vg,保留了其作为蛋黄前体的功能;而在马铃薯木虱取食受细菌性植物病原体CandidatusLiberibacter solanacearum感染的番茄植株后,Vg6-like在其消化道中表达量显著增加,在免疫防御中发挥作用(Ibanezetal., 2018)。叶蝉Nephotettixcincticeps唾液Vg蛋白可削弱植物的免疫反应(Wangetal., 2021);灰飞虱唾液Vg蛋白的末端多肽VgC通过与水稻抗灰飞虱转录因子蛋白OsWRKY71直接相互作用,抑制水稻H2O2的积累和抗灰飞虱取食的防御水平,体现了半翅目昆虫Vg与植物免疫调节剂对植物防御体系的联合效应(Jietal., 2021)。Vg与半翅目昆虫传播病毒密切相关。在烟粉虱BemisiatabaciaMED型感染番茄褪绿病毒(ToCV)后,Vg的相对表达量上升,其繁殖力提高,扩大了烟粉虱对ToCV的传播(Huangetal., 2021)。Vg影响植物的免疫防御系统有利于昆虫病毒入侵植株,同时一些病毒能够在传毒昆虫体内留存也与Vg有关。在灰飞虱中,只有当Vg存在时,水稻条纹病毒才能传播到卵母细胞(Huoetal., 2014);He等(2021)研究发现番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)的外壳蛋白与烟粉虱中肠中的Vg结合形成复合物后,促进病毒穿过昆虫载体的中肠屏障。Vg还与半翅目昆虫体内的共生菌传播有关。例如,褐飞虱中的酵母类共生体可通过Vg经卵巢传播(Chengetal., 2005);烟粉虱Vg蛋白影响其体内共生立克次体Rickettsia的水平(Bruminetal., 2020)。共生菌沃尔巴克氏菌Wolbachia利用灰飞虱的Vg蛋白跨卵运输系统进入卵巢,并通过滋养索进入发育中的卵母细胞,从而实现垂直传播。干扰灰飞虱Vg表达后,卵巢中及传递至卵母细胞的Wolbachia的数量均下降(Guoetal., 2018)。

2 半翅目昆虫Vg合成的激素调控

不同昆虫Vg的合成调控机制不同。内分泌激素调控昆虫Vg的合成主要发生在转录水平,包括保幼激素(Juvenile hormone,JH)、蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)和胰岛素样多肽(Insulin-like peptide,ILP)信号通路等(Engelmann, 1984;Koeppeetal., 1985)。在鳞翅目昆虫中,卵黄发生主要由保幼激素、蜕皮激素和胰岛素等来共同调控(Tufailetal., 2014);在双翅目昆虫中,卵黄发生主要由保幼激素和蜕皮激素二者共同调节(Kellyetal., 1987)。而在半翅目昆虫中,卵黄发生主要受保幼激素的调控(Wyattetal., 1996),同时与蜕皮激素和胰岛素激素等调控通路相互影响,共同调控Vg的合成。

2.1 保幼激素调控

JH由咽侧体(Corpora allata,CA)细胞合成分泌,是控制昆虫生长、发育、滞育及产卵等主要生理活动的关键信号通路之一(Linetal., 2015)。昆虫体内已经发现7种JH,包括JH0、JHI、JHII、JHIII、4-methyl-JHI、JHB3和JHSB3,其中JHIII是昆虫中分布最广的JH,而JH0、JHI、JHII仅在鳞翅目中发现,而JHB3仅在高等双翅目中发现(Matsumotoetal., 2021),JHSB3是在半翅目中发现的一种以跳跃双环氧化物结构为特征的新型JH(Kotaki, 1993)。半翅目昆虫JH有JHIII和JHSB3两种类别(表1)。

表1 半翅目昆虫发现的主要保幼激素种类Table 1 Major juvenile hormone category found in Hemiptera

JH作为半翅目昆虫中最主要的激素调控通路,对Vg的合成有重要影响。最早,Wigglesworth等(1936)证实在长红猎蝽Bhodnisprovirus中JH对卵成熟是必要的。Venugopal等(2000)在红蝽Dysdercuskoenigii中发现JH对合成和摄取Vg均有作用。在二点益蝽中,JHIII对中血淋巴Vg的组成有影响,外源JHIII处理会使其Vg提前合成(Coudronetal., 2005)。Ramos等(2020)在猎蝽科昆虫Dipetalogastermaxima中发现JH可以调节脂肪体中的Vg基因和卵巢中VgR基因的表达,对卵母细胞中的脂质储存至关重要。

保幼激素主要通过调节脂肪体中Vg的合成和促进Vg受体介导的内吞作用从血淋巴选择性摄取Vg蛋白(Santosetal., 2019)。Vg摄取过程中,昆虫的卵母细胞被一层紧密排列的卵泡上皮细胞包被,Vg等大分子营养物质必须要穿过上皮细胞层才能到达卵母细胞。研究发现,保幼激素可以增加卵巢卵泡上层细胞膜上Na+/K+-ATPase的活力,从而改变细胞内离子浓度平衡,导致细胞失水体积减少,卵泡上皮细胞之间出现大的胞间通道,帮助Vg到达卵母细胞(张闪静,2020)。一方面JH能够通过其受体Methoprene-tolerant(Met)介导的直接转录调控途径,调控昆虫Vg表达。Met是bHLH-PAS家族的一类转录因子,具有bHLH、PAS-A、PAS-B以及C末端等多个功能结构域,其中PAS-B可直接结合JH(Charlesetal., 2011)。干扰褐飞虱的Met基因,其卵的发生和Vg的表达均受到影响(Linetal., 2015)。另一方面,JH通过其受体Met触发其它转录因子,即Met结构中的bHLH与靶基因启动子上的保幼激素响应元件的JHRE结合,继而间接调控Vg基因的表达(Charlesetal., 2011;李东,2019)。未与JH结合的Met以同源二聚体的形式存在,当JH存在时,二聚体分离,Met与JH结合,同时Met-JH复合物与结合配体Steroid Receptor Coactivator(SRC)或Taiman(Tai)结合形成复合体,Met-JH-SRC/Met-JH-Tai复合体与Krüppel homolog 1(Kr-h1)等JH靶基因的启动子区域的JHRE结合,调控下游靶基因的转录(Jindraetal., 2015),这个过程需要磷脂酶C(PLC)在JH作用下使Met与SRC/Tai磷酸化,最终结合形成复合体(Ojanietal., 2016)。例如,始红蝽生殖发育过程中JH受体Met和其结合配体Tai作为关键的JH信号基因对Vg蛋白有调控作用,在诱导生殖条件下对Met或Tai基因进行RNA干扰可阻断始红蝽的卵巢发育、抑制Vg表达。在生殖滞育期间,Met和Tai的缺失与咽侧体的消融或JH的自然缺失有相同的影响,因此,Met-JH-Tai复合体在卵黄发生过程发挥作用(Smykaletal., 2014)。

JH也可以直接通过Kr-h1对Vg蛋白进行调控。Kr-h1被认为是JH早期诱导基因,是一种锌指蛋白,作用于Met的下游,参与卵黄发生和卵子发生。在褐飞虱中发现保幼激素受体Met基因和下游转录因子Kr-h1基因对卵巢发育和卵成熟有重要调控作用,在JH信号转导中表达(Gujaretal., 2016)。Ibanez等(2019)发现Kr-h1是柑橘木虱参与卵黄发生和卵子发生的重要的转录因子。

由此可知,JH调控半翅目昆虫Vg合成的主要过程是:咽侧体分泌JH,通过受体Met、PLC磷酸化、受体结合配体SRC/Tai及关键转录因子Kr-h1间的作用控制Vg遗传信息的转录,随后在脂肪体细胞的粗糙内质网上的核糖体进行翻译,最终合成的卵黄原蛋白被分泌到血淋巴中,被生长的卵母细胞摄取,摄取过程也受JH控制(图1)。

2.2 蜕皮激素调控

蜕皮激素是一类具有强蜕皮活性的类固醇激素,主要以20E形式存在,调控昆虫许多关键的发育阶段,包括蜕皮、变态和繁殖等(Wuetal., 2021)。20E在半翅目Vg合成和卵巢发育中的作用也得到部分证实,且与JH有一定互作(Cardinal-Aucoinetal., 2013)。直接敲除褐飞虱蜕皮激素合成酶基因,其卵黄减少、产卵下降、胚胎发育不足(Zhouetal., 2020)。敲除其他合成及调控20E的基因,半翅目昆虫的卵巢发育同样受到影响。例如,在马利筋长蝽Oncopeltusfasciatus中参与JH和20E合成的关键POU域转录因子(Ventral veins lacking,Vvl),可以调节20E和JH合成基因的表达,进而影响Vg的合成(Sarwaretal., 2019);在绿盲蝽中沉默参与20E信号的转导的必需磷脂酶C(PLC),影响其Vg表达量和卵巢发育(Tanetal., 2021);在黑肩绿盲蝽Cytorhinuslividipennis中,沉默参与20E合成的Shadow(Sad)基因显著降低了其Vg的表达和产卵量(Huetal., 2021)。

2.3 胰岛素激素调控

胰岛素信号通路在昆虫中主要起营养调节作用,影响生殖系统、调控JH和20E的生物合成(Smykaletal., 2015)。胰岛素信号通过胰岛素样肽(ILPs)和胰岛素受体(InR),通过结合胰岛素同源受体底物(Chico)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)等分子,进而激活PI3K途径和Akt途径等发挥作用。Akt是胰岛素信号传导的主要效应蛋白,可以通过抑制负调控物TSC1 and 2(Tuberous sclerosis complexes 1 and 2)来激活Vg合成的另一调控机制——“雷帕霉素靶位”(Target of rapamycin,TOR)营养信号通路(Wullschlegeretal., 2006)。卵黄发生受神经肽ILPs的控制,与胰岛素信号级联的下游靶标TOR一起,通过充当营养传感器在昆虫繁殖中发挥重要作用(Badiscoetal., 2013)。在褐飞虱中沉默InR基因导致Chico、Akt、PI3K基因表达下降,影响Vg的表达(Liuetal., 2020);长红锥蝽中胰岛素/ToR信号传导直接参与Vg的合成、影响产卵数量(Leyriaetal., 2021)。胰岛素信号通路也通过一些转录因子间接实现对Vg的调控。胰岛素信号通路的末端转录因子FoxO,可通过调节JH的降解控制昆虫的生长发育(曹冬梅和卢建,2006)。在褐飞虱中,FoxO基因直接与Vg外显子结合,影响Vg表达,调节其生殖力(Dongetal., 2021)。

3 半翅目昆虫Vg合成的非激素调控

3.1 TOR营养信号通路调控

TOR营养信号通路调控是通过控制JH和20E的生物合成和分泌来调节昆虫的营养状态,间接调节卵黄发生,刺激Vg的合成,激活卵子发生(Luetal., 2016)。在多数昆虫中,蛋白质或氨基酸(AAs)的摄入是激活卵黄发生的关键因素,其触发必需依赖TOR的上游调控因子小GTP酶Ras同系物(Rheb),而TOR的下游靶标S6蛋白激酶(S6K)的磷酸化是将AAs营养信号传导至繁殖雌性卵发育的关键步骤。RNAi介导的S6K或Rheb基因缺失会破坏Vg的表达并阻断卵子成熟,这表明TOR途径对于Vg合成和卵母细胞成熟的营养激活起重要作用(Hansenetal., 2005;Royetal., 2011)。研究证实,需要蛋白质或氨基酸营养物质来启动Vg合成的昆虫,需要通过TOR传输大量营养物质刺激来调节生殖系统发育(Pérez-Hedoetal., 2013)。在褐飞虱中TOR途径可诱导JH生物合成,进而调节氨基酸介导的Vg合成(Luetal., 2016);白背飞虱的TOR在马氏管中高表达,沉默TOR后,导致Vg表达显著降低,雌虫不产卵(Yietal., 2021);黑肩绿盲蝽的TOR途径调节Vg的合成、繁殖和种群增长(Zhuetal., 2020)。Guo等(2021)发现沉默柑橘木虱的TOR途径的正调控基因Rheb,会导致其20E和JH水平降低、Vg合成减少,生殖能力下降。

3.2 其他基因间接调控

研究人员陆续新发现一些非激素调控的基因对Vg的表达有影响。例如,在褐飞虱中发现了一种鞘磷脂酶(Sphingomyelinases,SMases),敲除SMase后,褐飞虱甘油二酯(DAG)代谢紊乱,中断Vg积累,导致其卵巢畸形(Shietal., 2022)。另有一类驱动蛋白超家族蛋白(Kinesin superfamily proteins,KIFs),能利用ATP的水解来推动微管的定向运动。下调KIF2A后,褐飞虱在转录和翻译水平上显著降低了Vg的表达(Gaoetal., 2021)。此外,Kang等(2018)在褐飞虱中发现有29个味觉受体Grs,其中有27个Grs与Vg和VgR的转录水平有关(Kangetal., 2018),干扰褐飞虱雌成虫的Gr7后,其卵巢中的Vg减少(Ojha and Zhang, 2021)。Zhang等(2022)沉默褐飞虱章鱼胺(OA)的受体OA2B2基因后,发现其卵巢和脂肪体中总蛋白浓度降低,Vg和VgR表达减少,卵巢发育和卵巢管中卵母细胞生长受到抑制,卵母细胞中Vg摄取的严重减少,繁殖和种群增长下降。

4 展望

昆虫生殖发育机制复杂,卵黄原蛋白及其受体的研究是昆虫生殖生理学研究的热点。除调控产卵等传统功能外,半翅目昆虫Vg的其他功能研究同样具有重要意义。超过一半的植物病毒由半翅目昆虫传播,包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马等。半翅目昆虫唾液中普遍存在Vg(Wangetal., 2021),其种类和功能分析是虫媒病毒-宿主相互作用研究领域的新热点,或可成为病虫害防治的新靶标。半翅目昆虫Vg合成主要以JH调控为主,其他激素调控还有待更深入的探索。例如,一般蜕皮激素可以通过简单的扩散穿过细胞膜进入靶细胞,但最新研究证明,黑腹果蝇Drosophilamelanogaster细胞摄取蜕皮激素需要一种蜕皮激素导入物(EcI)的膜转运蛋白,才能进入靶细胞结合蜕皮激素受体EcR发挥其基因组效应(Okamoto and Yamanaka, 2020),Hun等(2022)在蚊子体内也同样发现了这种蜕皮激素导入物(Hunetal., 2022),而在半翅目昆虫内是否有还未被发现的EcI基因类似导入物,这些也是值得探讨的研究方向。此外,不同半翅目昆虫在JH调控Vg合成中参与的调控因子也不尽相同,在研究中应注意物种差异性。例如,Kr-h1在始红蝽中参与卵黄发生和卵子发生,而在臭虫中则不影响Vg的合成(Smykaletal., 2014;Gujaretal., 2016)。这些研究将有助于进一步揭示半翅目昆虫的卵黄原蛋白的作用机理,能有效压低其种群数量并减少其扩散。同时从Vg合成调控机制中寻找靶标基因,通过基因编辑技术手段,研发有效靶标基因的dsRNA制剂等,为半翅目害虫的绿色防控、植株抗虫分子育种提供参考依据。