10℃下米象对糙米挥发性成分及前体物质的影响研究

田雪梅,郝佳容,周国鑫,刘兴泉*,张 涛*

(1. 浙江农林大学食品与健康学院,杭州 311300;2. 国家粮食和物资储备局科学研究院,北京 100037)

糙米是稻谷经砻谷机脱壳后而得到的全谷物颗粒米,由米糠层、胚、胚乳三部分组成,营养成分保存完好(张文昊等, 2013)。储运过程中糙米极易受到温度的影响,并伴随有虫害的发生。米象Sitophilusoryzae属鞘翅目象甲科昆虫,为世界性重要储粮害虫,其寄主范围广、繁殖力强、世代重叠和抗逆性强,对多种谷物及其加工品均可造成严重危害(杨悦玲等, 2021)。糙米因储粮害虫侵染或自身内源酶等作用会发生品质变化,包括脂质氧化和蛋白质降解反应,尤其是香气会受到影响(崔素萍等, 2008; 张玉荣等, 2019)。粮食挥发性成分大多来自脂肪酸和氨基酸的氧化降解。有研究表明,食品中不饱和脂肪酸的氧化通常与异味有关。糙米脂肪酸会发生自动氧化、酶促氧化、光敏氧化等反应,赋予特殊的香气,使其感官品质降低、风味劣化等(曹文明等, 2013)。氨基酸通过脱氢、脱羧反应生成酯类、醇类、酸类、醛类等化合物(穆德伦等, 2020)。有文献报道,谷物中酮类化合物大多源于不饱和脂肪酸的氧化或热降解、氨基酸降解或微生物氧化,通常具有清香气味(张敏等, 2017)。脂肪酸、氨基酸的变化会直接影响到挥发性成分的变化。小米煮熟后游离脂肪酸含量增加,其中棕榈酸对挥发物的形成没有贡献,而硬脂酸则通过脱羧产生十七烷,不饱和脂肪酸产生的挥发性成分最多(Lietal., 2021)。小麦在储藏过程中,己醇、辛醇的相对含量与脂肪酸的变化有显著相关性,十五烷、十六烷的含量与脂肪酸的变化相关性较显著(赵丹,2012)。水果中异亮氨酸含量的升高可以促进2-甲基丁基类挥发性化合物的合成(Matich and Rowan, 2007)。Porretta等(1995)发现超高压处理后游离脂肪酸被氧化形成了正己醛和己烯醛。

前人研究发现,10℃条件下害虫的代谢率、体内水分以及酶活性会降低,储藏前期仍可以活动,后期慢慢出现冷昏迷、活动受阻、不能取食,直至最终死亡(Jianetal., 2003)。10℃储藏条件下糙米的脂肪酸值低于准低温,生理变化过程受到抑制(陈永春等, 2019)。10℃被证实是在自然冷资源稻谷储藏仓中稻谷的最佳储藏温度,可以有效保证稻谷的储藏品质(施灿璨等, 2018)。曹俊等(2017)等对不同储藏温度下稻谷的挥发性成分进行检测,结果表明在低温(10℃)储藏时,检测到的稻谷挥发性成分最多。在相对湿度为85%、储藏温度为10～35℃条件下,稻谷的脂肪酸值、霉菌总数随着储藏温度的增加而逐渐增高(周建新, 2011);储藏温度为10℃、20℃、30℃条件下,10℃条件下稻谷的脂肪酸值、霉菌总数最低,有利于保证稻谷的品质(陈银基, 2016)。

与大米相比,糙米含有更多的蛋白质和脂质,所以氨基酸、脂肪酸氧化降解与挥发性成分的关系值得深究。有关米象侵染糙米的研究报道大多集中挥发性成分的变化规律,而脂肪酸、氨基酸、挥发性成分之间的联系研究少有报道。因此,本试验研究了10℃条件下米象侵染糙米后脂肪酸、氨基酸和挥发性成分的变化,筛选特征挥发性成分,分析了前体物质脂肪酸、氨基酸与挥发性成分变化之间存在的联系,为进一步探讨此过程中挥发性成分的变化机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糙米来自黑龙江省绥化市农户2020年晚粳稻,品种为绥粳18号。利用砻谷机将稻谷脱壳得到的糙米样品,过筛清除杂质,水分含量为13.4%。将该样品密封于自封袋中,进行-4℃低温处理一周,以消除样品中有害生物的影响(牛永浩, 2015)。

米象以全麦为饲料,培养于实验室恒温恒湿培养箱30±1℃、RH80%±1%、24 h无光照条件下,连续饲养10代以上。挑选发育处于同一阶段的2周龄成虫作为试验用虫。

氢氧化钾、氯化钠、氢氧化钠、石油醚(60～90℃)、浓硫酸、甲醇(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;正己烷、2-辛醇(均为色谱纯),阿拉丁公司;异硫氰酸苯酯(纯度>97%)、17种氨基酸标准品(纯度>98%)、2-辛醇(纯度>99.8%),Sigma公司;甲醇、乙腈,均为色谱纯,TEDIA公司;正构烷烃混合标准物质(C7～C40),上海安谱科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪:LC-20AT,配SPD检测器和自动进样器,日本岛津公司;气相色谱-质谱联用仪:GCMS-QP2010PLUS,配AOC-20I自动进样器,日本岛津公司;聚二甲基硅氧烷/碳分子筛/二乙烯苯(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm萃取头及SPME手动柄,美国Supelco公司;人工气候箱:MGC-300H,上海一恒科技有限公司;旋涡振荡器:QZ-866,海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1侵染实验

根据虫粮等级划分及等级指标(GB/T 29890-2013),将200 g糙米装入玻璃容器中混匀,接入20头米象(雌雄比14∶1),纱网封口后放入10±1℃,RH80%±1%的培养箱中进行5周的侵染实验。

1.3.2氨基酸组分的测定

称取0.1000 g样品置于水解管中,加入10 mL 6 mol/L盐酸,振荡使样品均匀分布在溶液中,于110±1℃烘箱中水解24 h,水解结束后取出冷却,取2 mL上清液于蒸发皿中在80±1℃下挥干溶剂,加入2 mL水溶解,过滤待衍生化。取1 mL样液分别加入14%三乙胺乙腈溶液和1.2%异硫氰酸苯酯乙腈溶液各0.5 mL,混匀,室温下静置1 h后,加入0.1 mL 20%乙酸,混匀,再加入2 mL正己烷提取,漩涡混合器震荡60 s后静置10 min,萃取反应过剩的异硫氰酸苯酯,取下层清液经0.45 μm有机滤膜过滤后待HPLC分析。

流动相A:乙酸钠缓冲液;流动相B:乙腈—水(4∶1);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:40℃;进样量:10 μL;洗脱程序如下所示(表1)。

表1 氨基酸洗脱程序

1.3.3脂肪酸组分的测定

参照许光利(2017)方法并适当修改,称取2.50 g米粉于50 mL离心管中,加入25 mL沸程为60～90℃的石油醚,于42℃、300 W下超声37 min,4 000 r/min离心10 min,将上清液于50℃旋蒸,分两次每次加入1 mL正己烷溶解脂肪以及20 μL的1 mg/mL十一酸(内标),合并至具塞试管中,加入0.5 mol/L KOH-CH3OH溶液2 mL,漩涡30 s,70℃水浴20 min,再加入0.5 mol/L H2SO4-CH3OH溶液4 mL,漩涡30 s,70℃水浴10 min,最后加入0.2 g NaCl促进分层,加入2 mL蒸馏水、正己烷,漩涡均匀进行萃取,静置分层,取上清液进行分析。

色谱柱为RXI-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);以高纯氦气为载气;流速为1.0 mL/min,分流比:50∶1;进样量1 μL;色谱柱升温程序:柱温100℃、以10℃/min升温至170℃,保持1 min;以3℃/min升温至230℃,保持12 min。离子源温度200℃,接口温度250℃,电离电压70 eV,溶剂切除时间3 min,全扫描模式,扫描速度1 666 amu/s,扫描离子范围45～500 amu。

1.3.4挥发性成分的测定

参照牛永浩(2015)方法并加以优化,称取8 g糙米样品于20 mL顶空瓶中并加入10 μL内标(2-辛醇,0.1 mg/mL)密封,于70℃水浴平衡30 min,萃取头萃取吸附70 min,进样口250℃条件下解析3 min。

色谱柱为RXI-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);以高纯氦气为载气,流速为1.0 mL/min,不分流;色谱柱升温程序:柱初温为45℃,保持5 min,以5℃/min升温至250℃,在250℃保持5 min。离子源温度200℃,接口温度250℃,电离电压70 eV,溶剂切除时间2 min,全扫描模式,扫描速度1 666 amu/s,扫描离子范围50～550 amu。

1.4 数据分析

所有指标均测定3次,结果用平均值±标准偏差表示。根据化合物保留时间计算保留指数,通过NIST08和NIST08s标准谱库以及正构烷烃标准品对化合物进行定性分析,检测出挥发性物质的峰面积与内标2-辛醇峰面积之比求得挥发性物质的绝对含量。按照检测出脂肪酸的峰面积与内标物十一烷酸的峰面积之比求得各脂肪酸绝对含量。根据氨基酸标准曲线求得氨基酸的绝对含量。使用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),以变量投影重要性值(Variable importance for the projection, VIP)大于1为指标筛选特征挥发性成分。使用SPSS 22.0 软件进行Pearson相关性分析,并用TB tools软件对相关性数据进行热图可视化。

2 结果与分析

2.1 不同侵染时间内米象侵染后糙米氨基酸、脂肪酸组分的变化

不同侵染时间内的糙米样品中共检测出17种氨基酸(表2),其中差异显著的氨基酸有8种。氨基酸不仅影响了米饭的口感、味道,还可以通过脱氨反应、脱羧反应等酶促反应产生醇类、醛类等香气物质(Zhaoetal., 2020)。糙米样品含量较高的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸,半胱氨酸含量较低,这与曹志洋等人的研究结果一致(曹志洋等, 2009)。随着侵染时间的延长,氨基酸含量呈现波动下降趋势,说明米象蛀蚀糙米造成了质量的损失(Belloetal., 2000)。但是丙氨酸和脯氨酸等个别氨基酸在某个时间点,含量较侵染初期显著上升,一方面是因为低温胁迫诱导蛋白质发生水解,氨基酸合成增强,从而促进了部分氨基酸含量的增加,另一方面是因为害虫产生的排泄物含有氨基酸(Thomsonetal., 2002),黏附在糙米表面,随着磨粉进入,促进了氨基酸含量的增加。

不同侵染时间内的糙米样品中共检测出11种脂肪酸(表3),其中包括6种饱和脂肪酸、5种不饱和脂肪酸。糙米中含有丰富的油酸和亚油酸,这两种不饱和脂肪酸的含量约占总含量75%,这与孙辉等人研究发现糙米含有丰富的不饱和脂肪酸结果一致(孙辉等, 2014)。随着侵染时间的延长,脂肪酸含量呈现先上升后下降的趋势,促进了糙米脂质氧化,同时脂肪酸发生氧化分解产生醇类、醛类、烃类等小分子物质(陶淑华等, 2020),导致风味品质及营养价值的降低。从第1周到第2周,糙米的脂肪酸含量均有所上升,其中亚油酸、油酸含量变化尤为明显,较初始增加了约44%,说明前两周米象尚未死亡,这与霍鸣飞等人(2017)的研究结果相似。随着侵染时间的延长,第3周时米象蛀蚀程度达到顶峰,造成糙米数量损失,脂肪酸含量有所下降。侵染后期米象活动受阻、不能取食,逐渐死亡,糙米脂肪酸含量趋于平稳。

表3 不同侵染时间内米象侵染后糙米脂肪酸组分的变化(mg/100g)

2.2 不同侵染时间内米象侵染后糙米挥发性成分的变化

采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术对不同侵染时间内米象侵染后的糙米挥发性成分进行对比分析,检测到56种挥发性成分(表4),其中差异显著的挥发性成分有29种。

表4 不同侵染时间内米象侵染后糙米挥发性成分的变化(μg/g)

检测出的醛类化合物中,己醛和壬醛这两种直链醛的含量最高,分别衍生自亚油酸和油酸(Sonetal., 2020),在10℃条件下,脂肪酸组分变化不明显,这两种醛类化合物差异不显著。庚醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E)-2-癸烯醛、2-十一烯醛、十二醛存在显著差异。庚醛是亚油酸氢过氧化物(LOOH)的分解产物以及脂氧合酶变化所引发的反应产物(Mathureetal., 2014),仅在侵染第5周时被检测到,1-戊醇和二氢-5-十四烷基-2(3H)-呋喃酮衍生自亚油酸氧化,也仅在第5周时被检测到(Choietal., 2019),说明侵染5周后糙米中的亚油酸发生氧化分解,产生特定的挥发性成分。(E,E)-2,4-壬二烯、(E)-2-癸烯醛、2-十一烯醛都是油酸的降解产物,通过脂肪酸的RO键的溶血裂变引起(Subramanian and Nakajima, 1997)。随着侵染时间的延长,油酸降解程度的加深,其含量先增加后减少,在侵染第4周均达到最大。

醇类化合物是糙米中的第二大挥发性成分,仅次于醛类,被认为是不饱和脂肪酸氧化的副产物,是由醛进一步分解形成的(Concepcionetal., 2018)。在整个侵染周期内,1-己醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、壬醇一直被检出,其中1-己醇含量最高,1-己醇是亚油酸的二次氧化产物,在侵染期间具有波动性,含量先下降后上升,庚醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、壬醇的含量无显著性差异。庚醇、1-辛醇、壬醇分别呈现绿色香气、蜡状醛香、花香,10℃条件下的糙米保留了原有的香气,变化不显著。1-辛烯-3-醇是通过亚油酸首先通过酶催化转化为10-氢过氧化物,然后通过内在裂解酶将10-羟基过氧化物分解得到(Lam and Proctor, 2003; Zhouetal., 2003),10℃条件下代谢途径的酶活性变化不大,因此侵染期间内差异不显著。

酮类化合物具有水果、草本香气,是糙米香气的重要贡献者。3,5-辛二烯-2-酮是不饱和脂肪酸的主要脂质氧化产物之一,曾被认为是脂质氧化的指示剂(Sonetal., 2020),随着侵染时间的延长,含量显著上升再下降,其它酮类化合物无显著差异。香叶基丙酮具有花香,是合成维生素E和异植物醇的重要中间体(刘先章, 1997)。6-甲基-5-庚烯-2-酮是糙米中有效的芳香活性化合物,曾被鉴定为发黄大米中的特征挥发物,与糖酵解途径的丙酮酸有关(Liuetal., 2021),这两种化合物在整个侵染周期内差异不显著,说明了在10℃条件下糙米自身代谢活动受到抑制,导致挥发性成分变化不显著。

糙米的大部分酯类化合物在不同侵染时间内差异显著,其中棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯是高级脂肪酸的乙酯衍生物,其含量的变化可能与脂氧合酶途径有关。根据文献报道,酯类化合物是通过醇和酰基辅酶A之间的酯化反应产生,来自脂肪酸脂氧合酶途径和氨基酸代谢,或者通过醛的酯化反应生成(Zhouetal., 2003),因此脂肪酸和氨基酸的变化导致酯类化合物差异显著,但究其每个化合物产生的途径还未明确。

米象侵染后糙米的部分烃类化合物存在显著差异,正十三烷、正十六烷、正十七烷这类烷烃化合物属于脂质降解产物(Verma and Srivastav, 2020),侵染周期内十七烷差异显著,说明10℃条件下米象侵染对脂质影响不大。此外害虫侵染过程中脱落的表皮脂质,被人证实含有正构烷烃,直链烯烃(Howard, 2001; Prasanthaetal., 2015),也是造成烃类化合物含量差异显著的潜在原因。

2.3 特征挥发性成分的筛选

根据挥发性成分组成和含量,对不同侵染时间内糙米挥发性成分进行偏最小二乘法-判别分析,得到PLS-DA模型得分图(图1-a),不同侵染时间的各样本分别聚集在5个不同区域,聚类趋势良好,不同侵染时间的样品明显区分。所有样品的相似度均在95%的置信区间内(图1-b),存在聚类趋势,未发现离群样品点。本实验建立的PLS-DA模型有良好的拟合参数,其中R2(X)=0.894、R2(Y)=0.976、Q2=0.833,说明模型的解释性和预测性好,无过度拟合。

图1 不同储藏时间内米象侵染后糙米挥发性成分的PLS-DA模型得分图(a)和Hotelling T2分布图(b)Fig.1 PLS-DA scores of volatile components of brown rice after Sitophilus oryzae infestation at different storage times(a)and Hotelling T2 distribution diagram(b)

通过PLS-DA分析,共筛选到18种VIP值大于1的挥发性成分,可以作为低温储藏期间米象侵染糙米的特征挥发性成分(表5)。1-十一醇、1-戊醇、二氢-5-十四烷基-2(3H)-呋喃酮和庚醛均是脂质氧化的产物,它们的含量与侵染时间呈正相关,庚醇含量与之呈负相关。一般认为,糙米的陈化劣变过程,主要就是糙米中的脂类水解为脂肪酸,脂肪酸再进一步氧化为醛、酮类物质的过程(贺梅等, 2007)。因此,随着侵染时间的延长,糙米中的脂肪酸开始氧化分解,促进了这些产物的生成或减少。

2.4 相关性分析

本研究表明,十七烷酸和木蜡酸分别与6种特征挥发性成分显著相关(图2)。庚醇与油酸呈显著正相关(P<0.05),与硬脂酸、山俞酸呈显著负相关(P<0.05),与木蜡酸呈极显著负相关(P<0.01)。丙氨酸和脯氨酸是与特征挥发性成分相关性最高的氨基酸组分,分别与4种、5种特征挥发性成分显著相关。邻苯二甲酸二异丁酯与丙氨酸极显著负相关(P<0.01),与亮氨酸显著负相关(P<0.05),与脯氨酸显著正相关(P<0.05)。十五烷酸甲酯与脯氨酸极显著负相关(P<0.01),与苏氨酸显著负相关(P<0.05),与丙氨酸显著正相关(P<0.05)。

图2 糙米特征挥发性成分与脂肪酸(a)、氨基酸(b)含量的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of characteristic volatile components with fatty acids(a) and amino acids(b) contents in brown rice注:*显著相关(P<0.05);**极显著相关(P<0.01)。Note: * meant significant correlation (P<0.05); ** meant extremely significant correlation (P<0.01).

3 结论与讨论

脂肪酸的氧化降解是挥发性成分产生的关键,脂肪酸合成挥发性成分的途径有3种:α-氧化、β-氧化和脂氧合酶途径,其中不饱和脂肪酸氧化分解生成氢过氧化物,氢过氧化物继续氧化分解生成醛类、酮类、醇类、烃类等挥发性成分(吴娜, 2017)。本研究发现,油酸与庚醇呈显著正相关(P<0.05),相关系数为0.594,这是由于油酸是不饱和脂肪酸,在储藏过程中发生过氧化而形成过氧羟基脂肪酸,裂解形成醛类或烯醛类化合物,醛类化合物经酶催化形成相应的醇类(Dixon and Hewett, 2000)。据文献报道,不饱和脂肪酸中的亚油酸、油酸是重要的香气前体物质。随着油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸含量增加,苹果的香气含量也增加(Song and Bangerth, 1996)。猕猴桃中风味前体物质亚麻酸、亚油酸的分解速率降低,使得酯类化合物的含量保持在较低的水平。

氨基酸是香气物质代谢途径中的前体物质,氨基酸通过脱氨、脱羧等反应形成了酸类、醇类、醛类、酯类等挥发性成分(梁奕等, 2021)。本研究发现,氨基酸与酯类化合物相关性较高。这是由于氨基酸通过转氨基作用形成支链酮酸,脱羧或脱氢后生成支链醛和酰基辅酶A,在醇脱氢酶和醇酰基转移酶的催化下形成支链酯类香气物质;由支链氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸代谢衍生形成的醛、醇和酯类是构成香气的重要组分。香蕉中亮氨酸可以转化为3-甲基醇类和酯类物质;番木瓜、草莓中支链的醇类和酯类化合物产生的前提物质是缬氨酸、丙氨酸;缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸被认为是它们是合成苹果中挥发性化合物的重要组成(裴龙英, 2018)。有报道表明苹果果实中氨基酸含量的变化影响支链挥发性化合物的释放。添加氨基酸使苹果和甜瓜果实增加相应支链挥发性化合物的产生(Gondaetal., 2010; Espinoetal., 2016)。水果中的酯类化合物通常来自氨基酸的代谢,相应的醛类是氨基酸代谢过程中的关键中间体,由脱羧和脱氨基形成反应,接着醛还原为相应的醇。在甜瓜中,脯氨酸、亮氨酸甲硫氨酸等氨基酸被代谢成数十种挥发化合物,赋予甜瓜独特的香气(Gondaetal., 2013; Gondaetal., 2018)。这些结果与本研究结果相似。

本研究探讨了10℃条件下米象侵染5周内糙米挥发性成分、氨基酸、脂肪酸的变化以及它们之间的相关性。利用GC-MS技术和HPLC技术分别对脂肪酸和氨基酸进行分析,发现米象侵染过程中糙米的氨基酸呈现波动下降的趋势,脂肪酸呈现先升高后降低的趋势,表明糙米中的脂质和蛋白质发生了氧化与降解。利用HS-SPME-GC-MS技术对不同侵染时间内米象侵染后糙米挥发性成分进行分析,醛类、烃类、醇类和酮类等化合物的含量呈现显著性差异(P<0.05)。通过对不同侵染时间内糙米挥发性成分进行偏最小二乘法-判别分析,得到18种特征挥发性成分,根据特征挥发性成分和脂肪酸、氨基酸的相关性分析得出,庚醇、邻苯二甲酸二异丁酯与油酸、亚油酸、丙氨酸、亮氨酸含量变化呈一定的相关性,说明在10℃条件下,米象仍存在缓慢的生命活动,促进了糙米氨基酸和脂肪酸的氧化降解,进而对挥发性成分的形成产生显著影响,但挥发性成分变化的相关机理还需进一步探究。