长链非编码RNA UCA1促进人骨髓间充质干细胞成骨分化研究

卢倩倩,张泽兵,王景云

(吉林大学白求恩口腔医学院,吉林 长春130021)

骨质疏松症、外伤和发育异常等常导致颌面部牙槽骨缺损和骨量不足[1]。一方面,限制了口腔修复方案的选择,临床上多数情况只能选择活动义齿来恢复缺失的牙槽骨,大大降低了咀嚼效率和固位力。另一方面,降低了口腔种植手术的成功率,通过植骨手术来增加骨量,给患者带来了更多的创伤和经济负担[2-4]。因此亟需寻求更加高效增加骨量的方法。人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)大量存在于颌骨骨髓腔中,能够成骨、成软骨向分化,其分化过程受很多分子调控[5-7]。

多种RNA分子调控着人骨髓间充质干细胞的成骨分化以维持骨稳态[8-10]。研究表明其中一些长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA) 通过与miRNA分子相互作用调控hBMSCs基因表达的信号通路,干预其成骨分化方向[11-13]。UCA1(urothelial cancer associated 1,UCA1)是一种高度特异化的lncRNA。作为一种大于200个核苷酸的非编码基因[14],UCA1几乎不编码蛋白质。基因芯片分析结果表明lncRNA UCA1在骨质疏松症患者的血浆中,和健康人相比明显升高[15],提示UCA1很可能在调控骨代谢平衡中发挥关键作用。其有一短一长两种主要形式,在本研究中分别记为UCA1a和UCA1b[16]。UCA1是否参与hBMSCs的成骨分化而影响骨代谢仍然未知。

本研究通过构建过表达lncRNA UCA1的慢病毒载体UCA1a和UCA1b及空载体感染hBMSCs,探究体外两种不同结构的UCA1是否调控hBMSCs的成骨分化,对利用分子干预干细胞的基因表达从而促进骨形成修复颌面部骨缺损具有深远意义。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

实验采用人骨髓间充质干细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃含5%CO2培养箱中培养,每3天换液1次,细胞融合度达到80%～90%时用Accutase细胞消化液以1∶2的比例传代。每次传代前冻存一定比例的传代细胞。后续实验使用第3至6代细胞。

1.2 感染和实验分组

UCA1的两种变体(UCA1a和UCA1b)的cDNA分别被亚克隆到慢病毒载体质粒CSII-CMV-MCS位于Nhe I和Xho I之间独特的限制酶酶切位点,并设立空载体慢病毒颗粒为对照组。实验分为4组:对照组1组为干细胞对照组;对照组2组为空载体对照组;UCA1a组为高表达UCA1a的实验组;UCA1b组为高表达UCA1b的实验组。感染HEK293T细胞72 h时采用Real-Time RT-PCR检测各组UCA1的表达水平。成功高表达UCA1后,依次感染各组hBMSCs。

1.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应Real-Time RT-PCR

感染72 h的细胞和诱导培养7 d、14 d和21 d的细胞,采用PureLink RNA Mini kit提取和纯化总RNA。Nanodrop2000测量所提取的RNA的浓度,使用iScript cDNA Synthesis Kit反转录得到第1链cDNA,第1链cDNA与特异引物当成模板完成Real-Time RT-PCR。扩增程序:95℃变性 30 s,39 个扩增循环,反应温度为 95℃ 3 s、60℃ 30 s。采用2-ΔΔCt方法计算目标基因相对于内参基因S29的表达量,所用引物序列如表1。

表1 PCR所用引物的核苷酸序列

1.4 茜素红染色

UCA1成功高表达后,更换成骨诱导培养基,每3 d半量换液1次,共诱导21 d。成骨诱导7 d、14 d和21 d时,完成茜素红染色。室温下,首先用100 ml蒸馏水溶解1 g茜素红,并用稀释氨水将pH值调至6.4,配制好茜素红染液。室温下每孔用4%PFA 1 ml固定10 min后,蒸馏水洗涤,加入1 ml刚配制的染液染色20 min,最后蒸馏水洗涤、放置干燥。

1.5 Real-Time RT-PCR测定成骨相关标志物的表达

按照上述方法测定成骨特异性基质蛋白碱性磷酸酶ALP、骨桥蛋白OPN、I型胶原COL1和成骨相关转录因子SP7和成脂分化关键转录因子PPARγ及脂类合成酶的关键基因LPL的mRNA表达水平。

1.6 统计学分析

每组3个样本量,操作验证3次。数据进行正态性检验并以平均值±标准差表示,采用SPSS 26处理分析,组间数据采用单因素方差分析,Tukey多重检验进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建UCA1稳定过表达的hBMSCs细胞系

UCA1a组和UCA1b组在21 d内相比于对照组维持稳定显著高表达UCA1,两对照组间无显著差异,模型构建成功(P<0.01),见图1。

图1 lncRNA UCA1基因高表达的检测

2.2 茜素红染色结果及分析

人骨髓间充质干细胞成骨诱导后7 d、14 d和21 d,分别进行油红O染色。成骨诱导7 d后各组无阳性结果。14 d和21 d后,染色面积加大,21 d相较于14 d各组人骨髓间充质干细胞染色颜色加深加厚,表明矿化结节增多,钙盐沉积量增多,见图2。

图2 成骨诱导14 d、21 d时茜素红染色结果

2.3 成骨关键基因的Real-Time RT-PCR结果及分析

COL1I型胶原,作为成骨细胞分化成熟的早期标志,两组实验组7 d和14 d时相对于对照组表达水平均明显上调,差异有统计学意义。在21 d时,Col1在4组中的表达量相较于7 d和14 d时均减低。ALP作为成骨细胞分化成熟的早期标志,mRNA的表达水平在两组实验组UCA1a组和UCA1b组中14 d和21 d时,相对于两组对照组均明显上调,且相较于7 d时明显增加见图3。另外,14 d时,实验组OPN和SP7的表达均高于对照组,P<0.05,差异有统计学意义。综上结果表明UCA1高表达组细胞成骨分化能力明显增强,骨形成增强。

3 讨论

UCA1作为成骨分化的正调控分子,在骨代谢中扮演重要角色。LI等[16]发现骨质疏松症患者血浆UCA1表达明显升高。SHU等[17]的研究表明,UCA1通过miRNA-145-5p/SMAD5和miRNA-124-3p/SMAD4轴促进BMSCs向软骨分化。ISHIKAWA等[18]发现UCA1在成软骨分化过程中呈明显高表达趋势。然而,UCA1是否通过参与BMSCs 的成脂分化和成骨分化平衡而影响骨质疏松症的发生发展仍然未知[19-20]。本研究探讨了UCA1对hBMSCs成骨分化的影响,结果表明随着两种结构的UCA1持续高表达,细胞在14 d时成骨分化能力均明显增强,骨形成增强,但在21 d时,成骨关键基因的mRNA水平相比于14 d均显著减低。结合实验结果和前人的实验发现,UCA1在成骨功能减弱的骨质疏松症患者血浆中上调,却在体外实验中有一定促进骨形成的功能。骨质疏松症患者还有脂肪大量堆积对成骨功能的影响[21-22],有可能是患者体内成脂相关分子竞争抑制UCA1相关靶点的成骨信号通路,加强脂肪堆积。有研究表明未来有望在种植体周围释放适量的某种药物通过上下游干预UCA1的基因表达,进而调控hBMSCs的分化,从而增强促骨形成功能。

值得注意的是,纵向观察实验7 d、14 d和21 d的成骨基因表达水平变化,发现在21 d时两种过表达UCA1的实验组细胞相关基因的mRNA水平相对于14 d时均减低。有可能是因为在21 d时UCA1的表达量过高,通过某种机制对相关基因的调控产生了不同作用。也有可能是UCA1对hBMSCs相关分化的不同阶段作用方式和强度不同,具体机制仍需深入研究。另一方面,关于UCA1促成骨方面的作用,采用不同的研究模型得出的结果并不一致。ISHIKAWA等[18]通过构建稳定敲除UCA1的小鼠成骨细胞MC3T3-e1细胞系,发现沉默UCA1能显著促进成骨细胞MC3T3-e1的增殖和分化。最后Western blotting分析骨形态发生蛋白2(BMP-2)/(SMAD5/8)信号通路的表达,显示UCA1的作用可能是通过成骨细胞BMP-2/(SMAD5/8)信号通路介导。下调UCA1可通过激活成骨细胞BMP-2/(SMAD5/8)信号通路促进成骨细胞增殖和分化。本实验结果表明 UCA1过表达在hBMSCs成骨诱导14 d时成骨关键基因ALP、Col1、OPN及SP7的表达均增强,且形态学染色观察到相同结果,但其体内实验作用结果尚不可知。

近期热点分子lncRNA调控hBMSCs 分化的研究大量涌现[23],但是大部分 lncRNA 仅被确定为 BMSCs 成骨分化的促进或抑制因子。本研究的结果表明UCA1过表达在体外细胞水平能够促进hBMSCs的成骨分化,可为后续深入研究修复骨缺损疾病的分子治疗提供一定的参考价值。