苍夷滴鼻油对小鼠鼻黏膜损伤的修复作用及紧密连接蛋白表达的影响※

杨 钤,杨履世,贾力莉,宋美卿,牛艳艳,白崇智,王若瑜,冯玛莉

(1.山西省中医院,山西 太原 030012;2.山西黄河中药有限公司,山西 太原 030012)

鼻炎是鼻腔的慢性炎症性疾病,主要由鼻黏膜充血、水肿等炎性损伤引发。修复对于保护鼻黏膜组织生理结构,防御病原微生物入侵,减少黏性分泌物,减轻充血、水肿、炎症细胞浸润等炎性反应具有重要作用。存在于上皮细胞间的紧密连接(TJs)主要作用是封闭相邻细胞间的接缝,阻挡溶质沿细胞间隙渗入体内,构成机体与外界环境的第一道屏障,在鼻黏膜修复机制中发挥了关键作用。紧密连接蛋白包括跨膜蛋白Occludin、Claudins、JAMs、胞质附着蛋白ZO家族及与其相连的细胞骨架蛋白[1]。研究发现,当鼻黏膜受损时,紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin在黏膜上皮中的表达强度明显下降,破坏上皮屏障功能[2-3]。

苍夷滴鼻油由苍耳子、白芷、辛夷油、冰片、薄荷油等药物组成,具有通鼻窍、散风寒的功效。苍夷滴鼻油具有通鼻窍和排出分泌物的作用,对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌及肺炎链球菌均有不同程度的抑制作用(山西黄河中药有限公司苍夷滴鼻油临床应用经验总结)。本品以苍耳子、辛夷为君药。苍耳子始载于《神农本草经》,性温,味辛、苦,归肺经,具有散风寒、通鼻窍、祛风湿的功效。药理学研究表明,苍耳子具有降血糖、抗过敏、抗炎、镇痛、抗肿瘤、降血脂等作用[2]。辛夷性温,味辛,归脾、胃经,具有散风寒、通鼻窍等功效。药理学研究表明,辛夷具有降压、抗炎、抗组胺、抗过敏、镇痛等作用[4]。

为证实苍夷滴鼻油对鼻黏膜损伤的修复作用及其可能通过恢复黏膜上皮紧密连接蛋白表达的作用机制。本研究建立鼻黏膜损伤小鼠模型,观察苍夷滴鼻油对鼻黏膜红肿程度、组织病理改变及紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达的影响。

1 材料

1.1 实验试剂 甲醛,购自天津市申泰化学试剂有限公司,批号20171210;乙二胺四乙酸(EDTA),购自国药集团化学试剂有限公司,批号20190315;PBS 缓冲液(即用型干粉),购自Biosharp Life Sciences,批号21183986;ZO-1免疫组化一抗(兔抗小鼠),购自北京博奥森生物技术有限公司,货号bs-1329R,批号BA03303484;Claudin-1免疫组化一抗(兔抗小鼠),购自北京博奥森生物技术有限公司,货号bs-1428R,批号AI10091875;Occludin免疫组化一抗(兔抗小鼠),购自北京博奥森生物技术有限公司,货号bs-10011R,批号BA01222167;二抗(含内源性过氧化物酶封闭液、链霉亲和素溶液)(山羊抗兔),购自北京博奥森生物技术有限公司,货号SP-0023,批号BJ09074420;DAB显色试剂盒(20×),购自北京中杉金桥生物技术有限公司,货号ZLI-9019,批号232010302。

1.2 实验动物 清洁级昆明(KM)小鼠共60只,雌雄各半,体质量18~20 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0008。实验动物质量合格证号:110322210100720285。饲养于山西省中医药研究院中心实验室动物房,自由进食进水,温度为(22±1)℃,相对湿度为40%~60%。动物伦理审查编号:SZYLY2021KY-0101。

1.3 主要仪器 全自动脱水机(Excelsior,美国Thermo公司);石蜡包埋机(TKY-BMB,湖北康泰医疗设备有限公司);旋转石蜡切片机(F325,德国Thermo公司);万能荧光成像系统(BX51-DP72,日本奥林巴斯)。

2 方法

2.1 分组方法 按照均衡随机法将60只KM 小鼠分为空白对照组、模型对照组、滴通鼻炎水阳性对照组及苍夷滴鼻油高剂量、中剂量、低剂量组,每组10只。

2.2 鼻黏膜损伤小鼠模型制备方法 参考文献[5]的造模方法,用蒸馏水替代生理盐水进行预实验,根据预实验结果确定模型制备方法:除空白对照组,其余组均以70℃蒸馏水50μL滴于小鼠双鼻中隔黏膜,每分钟1次,滴30次。

2.3 给药方法 将滴通鼻炎水(广州白云山医药集团股份有限公司白云山何济公制药厂,国药准字Z44022586,规格:每瓶15 m L)与生理盐水按照1∶4比例稀释为滴通鼻炎水混悬液。将苍夷滴鼻油(山西黄河中药有限公司,国药准字Z20053699,规格:每瓶10 m L)与溶媒(山西黄河中药有限公司提供,为不含苍夷滴鼻油药味的基质)按照4∶1、2∶3、1∶4的比例分别稀释为高、中、低浓度的苍夷滴鼻油混悬液。空白对照组、模型对照组不做处理。滴通鼻炎水阳性对照组给予滴通鼻炎水混悬液治疗,滴鼻量为5μL/(只·次·侧);苍夷滴鼻油各给药组给予高、中、低浓度的苍夷滴鼻油混悬液治疗,滴鼻量为5μL/(只·次·侧),头部斜下方20°滴入鼻腔两侧,停留30 s。每日两次,连续给药7 d。

3 药效观察

3.1 观察指标 ①鼻黏膜红肿程度。给药7 d后,取刺激区鼻中隔黏膜(带软骨),肉眼观察肿胀、淤血程度并评分。0度:未见肿胀、淤血,与正常状态比较,未发生损伤,计0分;1度:可见肿胀,未见淤血,与正常状态比较,轻度损伤,计1分;2度:可见肿胀、淤血,与正常状态比较,中度损伤,计2 分。②鼻黏膜病理组织学。给药7 d后,取刺激区鼻中隔黏膜(带软骨)放入10%甲醛溶液固定12 h,10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙3 d后,脱水、浸蜡、包埋、切片,HE染色后光镜下观察各组小鼠黏膜组织结构变化,包括假复层柱状上皮细胞、毛细血管排列整齐与否,分泌腺体是否结构清晰,毛细血管、腺体数量变化,以及黏膜与软骨的密接程度等。③鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin免疫组化。上述病理组织石蜡切片常规脱蜡至水,微波抗原修复,高火3 次,每次5 min。内源性过氧化物酶封闭液室温孵育10 min,PBS缓冲液洗涤3次,每次3 min。封闭用正常山羊血清工作液室温孵育10 min,甩干,一抗工作液(ZO-1,1∶250;Claudin-1,1∶200;Occludin,1∶400)4 ℃过夜孵育,PBS缓冲液洗涤3次,每次3 min,二抗工作液室温孵育10 min,PBS缓冲液洗涤3次,每次3 min。HRP标记的链霉亲和素溶液室温孵育10 min,缓冲液洗涤3次,每次3 min。DAB工作液显色(显色程度镜下控制),苏木素复染,脱水透明封片。染色时同批进行空白对照。每张切片随机选取5个视野采集图像,放大倍数为200倍。采用Image J图像分析系统进行图像分析。

3.2 统计学方法 采用GraphPad 8.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3.3 结果

(1)鼻黏膜红肿程度比较 模型对照组红肿评分高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,滴通鼻炎水阳性对照组、苍夷滴鼻油高剂量组红肿评分均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与滴通鼻炎水阳性对照组比较,苍夷滴鼻油高剂量组红肿评分虽有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。图1见本期第125页。

表1 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜红肿程度比较(分,±s)

表1 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜红肿程度比较(分,±s)

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,▲P<0.05。

组别只数红肿评分空白对照组10 0.707±0.025模型对照组10 0.781±0.064△滴通鼻炎水阳性对照组10 0.739±0.042▲苍夷滴鼻油高剂量组10 0.707±0.025▲苍夷滴鼻油中剂量组10 0.731±0.041苍夷滴鼻油低剂量组10 0.760±0.058

图1 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜损伤红肿程度

(2)鼻黏膜病理组织学 空白对照组:鼻黏膜表面被覆假复层柱状上皮细胞,排列整齐,毛细血管规则,分泌腺清晰,可见杯状细胞,胞核规则。模型对照组:鼻黏膜上皮细胞损伤,表皮细胞明显剥脱,上皮细胞水肿,杯状细胞肥大;基底膜层破坏,黏膜上皮层下血管明显扩张,血管数量增多,固有层间质水肿,腺体肥大,腺管扩张,有大量炎症细胞浸润,整个黏膜层增厚,结构出现紊乱。滴通鼻炎水阳性对照组:表皮细胞未见明显剥脱,上皮细胞水肿程度、杯状细胞肥大程度减轻;黏膜上皮层下血管数量增多不明显,固有层间质水肿好转,肥大腺体数目较模型对照组减少,腺管扩张状态好转,炎症细胞浸润明显减少,整个黏膜层厚度变薄,结构趋于整齐。苍夷滴鼻油高剂量组:表皮细胞未见明显剥脱,上皮细胞水肿程度、杯状细胞肥大程度明显减轻;黏膜上皮层下血管数量增多不明显,固有层间质水肿明显好转,肥大腺体数目明显减少,腺管扩张状态好转,炎症细胞浸润明显减少,整个黏膜层厚度变薄,结构趋于整齐。苍夷滴鼻油中剂量组:表皮细胞未见明显剥脱,上皮细胞水肿开始减轻,杯状细胞肥大不明显;黏膜上皮层下血管扩张有减轻,血管数量增多不明显,固有层间质水肿减轻,腺体体积变小,腺管扩张状态、腺管结构好转,固有层炎症细胞浸润减少,整个黏膜层增厚及结构紊乱出现好转。苍夷滴鼻油低剂量组:黏膜上皮细胞损伤,表皮细胞明显剥脱,上皮细胞水肿,杯状细胞肥大,分泌旺盛;基底膜层破坏,黏膜上皮层下血管数量增多不明显,固有层间质水肿,腺体肥大,腺管扩张,有大量炎症细胞浸润,整个黏膜层增厚及结构出现紊乱程度较模型对照组略轻。图2见本期第125页。

图2 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜组织病理学(×200倍)

(3)鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平比较 模型对照组ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平均低于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。滴通鼻炎水阳性对照组、苍夷滴鼻油高剂量组、苍夷滴鼻油中剂量组ZO-1表达水平及滴通鼻炎水阳性对照组、苍夷滴鼻油高剂量组Claudin-1、Occludin表达水平均高于模型对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。苍夷滴鼻油高剂量组ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平与滴通鼻炎水阳性对照组比较,均无统计学差异(P>0.05);苍夷滴鼻油高剂量组ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平与模型对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。图3见本期第125页。

表2 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平比较(±s)

表2 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平比较(±s)

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,▲P<0.05;与滴通鼻炎水阳性对照组比较,★P<0.05。

组别鼠数ZO-1 Claudin-1 Occludin空白对照组5 0.286±0.008 0.282±0.010 0.254±0.010模型对照组5 0.220±0.009△0.237±0.014△0.230±0.014△滴通鼻炎水阳性对照组 5 0.296±0.011▲0.297±0.044▲0.267±0.002▲苍夷滴鼻油高剂量组5 0.290±0.020▲0.282±0.010▲0.261±0.010▲苍夷滴鼻油中剂量组5 0.276±0.011▲★0.261±0.006★0.244±0.008★苍夷滴鼻油低剂量组5 0.238±0.019★0.250±0.017★0.218±0.013★

图3 6组鼻黏膜损伤小鼠鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达(×200倍)

4 讨论

4.1 鼻黏膜损伤的中医病因病机分析 导致鼻窍疾病发生的基本病因很多,外因主要为外感六淫、异物入鼻,内因主要为脏腑失调。风邪具有升发、向上、易袭阳位的特性,鼻属阳中之阳窍,故外邪犯鼻以风邪为主。风为百病之长,寒、暑、火、热邪常依附于风邪,而湿邪则易与他邪兼夹致病。病毒、过敏原、细菌、空气悬浮粉尘及外界冷热空气变化等因素均可导致鼻病发生。除外感导致鼻病外,脾胃热盛、肺脏虚弱、气血失调均可导致鼻病发生。鼻为多气多血之窍,脾统血,若脾热移肝或胃火上攻,易致血不循经,流溢脉外而发衄血。肺主鼻,肺气宣发,则宗气、卫气布散于鼻,鼻窍得以温煦,方能温和通利。若肺气不足,不能宣发,易被邪毒侵袭而发鼻病。此外,气血失调必然累及机体各项生理功能,导致疾病发生。

4.2 鼻黏膜损伤模型制备方法研究 针对鼻黏膜损伤的实验研究发现,PM2.5刺激随浓度升高和时间延长,鼻黏膜上皮细胞之间紧密连接完整性明显降低[6];低氧可诱导鼻黏膜上皮细胞释放高迁移率族蛋白B1(HMGB1),促进黏膜上皮屏障损伤[7];兔的正常鼻黏膜经过光动力疗法(PDT)干预后会出现可恢复性损伤[8];大鼠鼻黏膜上皮损伤,甲硝唑、环丙沙星、庆大霉素经鼻给药两周,停药后损伤黏膜迅速修复[9];通过病理形态和透射电镜观察,4、6、8 Gy剂量一次性照射均能很好地建立小鼠鼻黏膜急性损伤模型[10]。此外,对不同水温刺激后大鼠鼻黏膜损伤及修复过程的组织形态学改变的研究发现,50℃、70 ℃生理盐水滴鼻30次(每分钟1次)刺激大鼠鼻中隔黏膜后,均可引起鼻黏膜损伤,50℃组两周后即可修复,70 ℃组在第28日仅少数恢复,第42日后仍未完全恢复[5]。本研究参考文献[5],用蒸馏水替代生理盐水,通过预实验观察鼻黏膜损伤小鼠模型制备的可行性及损伤持续的时间,采用70 ℃蒸馏水50μL滴在小鼠双鼻中隔黏膜,每分钟1次,滴30次,致小鼠鼻黏膜热损伤。

4.3 鼻黏膜上皮紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin作用分析 鼻黏膜细胞间的连接方式主要有TJs、黏附连接(AJs)、桥粒及缝隙连接4种[11]。其中,TJs是形成表皮渗透屏障和维持屏障功能的先决条件。研究发现,TJs是由多种蛋白构成的大分子复合物,呈连续的带状结构,围绕着上皮或内皮细胞,在调节物质旁细胞转运、维持细胞极性及细胞增殖、迁移、存活、分化等过程中发挥重要作用[12]。蛋白激酶C(PKC)是一类磷脂依赖性蛋白激酶,可催化多种蛋白质磷酸化,PKC介导的磷酸化和去磷酸化可调控TJs的分布和功能。作为第1种被发现的紧密连接跨膜蛋白,相邻细胞间Occludin蛋白相互结合,参与调控旁细胞通透性及维持细胞极性。当细胞中PKC含量过高,会导致已磷酸化的Occludin蛋白去磷酸化,跨膜电阻值(TER)明显下降,细胞极性和细胞间通透性遭到显著破坏[13-14]。此外,Occludin蛋白过表达导致16HBE 细胞的TER 增加,FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)降低,进而显著抑制HMGB1,导致气道上皮屏障功能损伤[15]。当敲除Occludin基因后,小鼠肠道和膀胱上皮的旁细胞通透性并未发生改变,提示Occludin可能不是构成TJ复合物所必需的结构蛋白,尽管如此,Occludin基因敲除小鼠仍然存在很多表型异常,如生长阻滞、胃黏膜上皮细胞慢性炎症和增生、睾丸肥大、唾液腺纹状管细胞浆内的分泌颗粒缺失等,说明在TJ的通透性调节功能方面,Occludin蛋白仍发挥着关键作用[16]。Claudin家族共有27个成员,分布于所有的上皮和内皮组织。其中,Claudin-1被认为是机体旁细胞屏障中较为重要的TJ蛋白,广泛表达于各种上皮组织。敲除Claudin-1基因的小鼠因水电解质严重失调,仅能存活1 d[17]。目前,ZO家族中ZO-1是TJ中第1个被发现的胞浆蛋白,构成TJ网状结构的“桥梁”分子,是参与TJ组装与信号转导的关键分子。研究发现,MDCK 单层细胞中ZO-1敲低会伴随肌动蛋白和肌球蛋白形态学改变和重组,进而降低TER 值,增加示踪分子透过率[18]。综上,ZO-1、Claudin-1、Occludin对表皮、上皮和内皮等屏障功能的维持发挥关键作用。

滴通鼻炎水喷雾剂可祛风清热、宣肺通窍,治疗伤风鼻塞、慢性鼻炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎等疾病临床疗效确切,因此在本研究中作为阳性对照药。另外,根据人用剂量,将苍夷滴鼻油用量由每日数次折算为每日1次,按照苍夷滴鼻油∶溶媒=4∶1、2∶3、1∶4分别设置高、中、低剂量组,经滴鼻治疗7 d后,苍夷滴鼻油高剂量组鼻黏膜损伤红肿程度明显减轻,且可明显上调鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平,保护鼻黏膜表皮完整性,减轻上皮细胞水肿和杯状细胞肥大程度,减轻间质炎症细胞浸润,降低黏膜厚度,促进鼻黏膜结构恢复。本研究结果证实,苍夷滴鼻油对鼻黏膜具有保护作用,其作用机制可能与上调鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达有关。本研究通过制备鼻黏膜损伤小鼠模型,证明苍夷滴鼻油对鼻黏膜损伤具有治疗作用,并对其作用机制进行初步探讨,但苍夷滴鼻油对机体的调节作用仍需进一步深入研究。