不同处理对土沉香生长和结香的影响

王东光，郭淑红，徐大平，张宁南

（1.惠州学院，广东 惠州 516007；2.中国林业科学研究院热带林业研究所，广东 广州 510520）

土沉香Aquilariasinensis(Lour.) Spreng.，为瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria木本植物。不同地域的土沉香有香材（海南）、白木香（广东等地）、女儿香（广东）、莞香（广东）等别称[1]，《名医别录》谓之沉香。健康生长的沉香树体不会结香，雷电侵袭、人类干扰或昆虫啃食等条件附加于沉香树体后，树体发生抗逆反应，或有内生真菌参与其次生代谢反应，就可能形成富含倍半萜、色酮、酚类等化合物的油性树脂，含有树脂的木片或木块密度可达1.028 g·cm-3，可沉水，所以称之为沉香[2]。无论老幼沉香树木若未受胁迫发生抗逆反应，其木质部横截面均呈均匀的黄白色，没有明显的心材和边材的分界线[3]。只有受伤的树体，其木质部才可能有颜色深浅不一的斑块状或条带状分布，其中变色部位中未腐烂的部分富含沉香物质，这与其木质部中岛形的内涵韧皮部的分布直接相关[4]，这也使得测定结香面积成为难题。近年来，野生沉香资源已接近枯竭，沉香属全部树种现已被《野生动植物国际贸易公约》（CITESⅡ)列为濒危物种[5]。天然沉香资源的匮乏，促进了人工培育沉香树结香方法的发展，人工促进沉香树结香具有较高的效率，人工促进1 a后就可以获得较高质量的沉香[6]。

人工促进沉香树结香的技术已经有了较大发展，但传统的人工造香技术所需结香周期长，新兴技术包括化学试剂法和生物诱导法等产生的沉香安全性备受质疑，且沉香结香量的测定非常困难，都制约了人工促进沉香结香技术的发展[7]。近年来，沉香市场的需求量急剧增长，土沉香种植面积急速增加，截至2020年，仅在广东惠州土沉香树种植面积已超6 000 hm2，如何高效促进土沉香结香且有效地测定或评价结香已迫在眉睫。沉香是沉香树受胁迫和抵御胁迫产生的抗逆性物质[8]。植物环境胁迫包括生物和非生物两种，其中非生物胁迫包括盐胁迫[9]、水分胁迫和低温胁迫等，生物胁迫包括真菌等微生物侵染和动物啃食等[10]。植物激素在植物体内的水平，通过影响信号转导等途径制约抗逆反应的发生[11]。众多研究表明，茉莉酸甲酯[12]、乙烯利[13]等植物生长调节剂和植物激素、氯化钠等无机盐[14]以及木霉属Trichodermasp.[15]、镰刀菌属Fusariumsp.、青霉属Penicilliumsp.和毛壳属Chaetomiumsp.等属[16]的真菌均可以诱导沉香结香。受到生物或非生物胁迫的植物，可能会“故意”减缓生长，而且这种反应通常是系统性的[17]，未见沉香树生长和防御权衡的研究报道。

本研究分别以植物生长调节剂、无机盐和真菌为促进剂，对沉香结香过程中树体生长的变化进行研究，探索无损型荧光光谱成像技术测定结香数量的有效性，综合生长量、醇溶性浸出物含量和结香数量（结香长度和最大结香面积）等指标首次进行土沉香生长和防御相关性分析，采用主成分得分法评价土沉香生长和结香的平衡关系，以期为人工高效促进土沉香结香提供一定的理论依据和实践参考。

1 研究区概况

试验地位于广东省东部惠东县横瑶村（116°06′00″E，24°15′54″N），海拔96 m，处于南亚热带季风气候区，年平均气温约为21.9 ℃，年降水天数约为109 d，年均降水量为1 356 mm，年辐射量约为58.9 kWh/m2，年相对湿度约为80%，年蒸发量约为1 875 mm，常年基本无霜，土壤为山地红壤。

2 研究方法

2.1 试验材料与设计

本研究设置了植物生长调节剂处理组（T1）、无机盐胁迫处理组（T2）和真菌菌液（T3）共3个处理组，每个处理组内包含4个处理。其中植物生长调节剂浓度极低，无机盐亦采用低浓度且Fe和Na等均为人体所需的微量金属元素，真菌为结香树体所分离的非致病菌，其安全性有保障。不同处理组中，T1处理组为茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA)、6-苄氨基嘌呤（6-BA）和乙烯利（ETH）等植物生长调节剂混合制剂，T2为氯化钠（NaCl）、氯化亚铁（FeCl2）和亚硫酸氢钠（NaHSO3）等无机盐混合物，T3为真菌菌液（浓度及其他指标见表1）。T1和T2各处理中化合物种类及水平根据前期试验数据确定[18]。真菌菌种在液体培养基上培养完成后，用细纱网过滤后得到菌液。采用随机区组试验设计的分组方法选取胸径约为10 cm的土沉香树（8年生树，处理前生长特性等指标无差异），设3个区组，每个区组包含12个处理和1个对照，每个处理每个区组重复6株。

表1 不同处理土沉香树生长量差异†Table 1 The increment of the A.sinensis trees under different treatments

于2018年12月对树体进行最后一次处理。将上述溶液或菌液200 mL，装入液体滴注装置注入树体，利用树体蒸腾作用，使结香剂随树液流动，侵染或胁迫整株树[19]，具体方法参见前期研究[18]，设置蒸馏水注射液为对照组（表1）。

2.2 测定指标和方法

2020年10月（即结香时长为1年8个月）进行取样调查，生长量即为处理前后树高、胸径（距地面1.3 m处树体直径）和冠幅的增量。在每个区组中选取一个处理的3次重复样本株，将其伐倒，分段带回实验室，进行醇溶性浸出物含量和结香面积、长度等指标的测定。

先切削截取圆盘的白木部分，再用钩刀剔除腐木部分，剩余的结香木料用于醇溶性浸出物的提取。醇溶性浸出物提取采用有机溶剂（95%乙醇）萃取法，旋转蒸干后测定其含量[18]。结香面积测定前，先将结香树干沿径向进行树干解析，每个树木圆盘的厚度为5 cm，直至横截面完全为白木为止。采用荧光光谱成像技术测定树木圆盘结香面积[19]，扫描得到样品的光谱立方体后进行判别分析，测得白木、结香层、腐木和背景的面积[20]。具体测定过程为：先用紫外灯照射待测的木块，将光学滤片设置在CCD（电荷耦合元件）相机和样品之间，使样品的激发光通过滤片成像于相机上，从而获得一组光谱立方体。通过之前已经获得的白木、腐木和结香层的光谱曲线从光谱立方体中确定白木和腐木的部位，再通过对白木和腐木面积取交叉互补集得到沉香的边缘，采用数字图像填充内部和外部边缘之间的区域，最终测算得沉香的面积。

2.3 数据处理

采用Excel 2016软件整理数据，运用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，均值多重比较采用Duncan法进行检验，采用迈维云平台高级相关性聚类热图法进行相关性分析。

3 结果与分析

3.1 不同处理对土沉香生长的影响

不同处理对土沉香胸径生长有显著影响，对树高和冠幅生长影响不显著（表1）。不同处理组中，胸径增长量最小的处理分别为T1处理组的MeJA、ABA、6-BA和ETH为0.05、0.5、0.01和0.01 mg·g-1（4号处理）、T2处理组的3、10和20 mg·g-1（8号处理）以及T3处理组的龙眼焦腐病菌真菌菌液（12号处理），处理末期胸径增量分别为对照的0.51、0.49和0.47倍。各处理组中，胸径增量最大的处理分别为3、7和11号处理，为对照的60.2%、61.9%和63.6%。进一步分析可得，T1处理组中土沉香树胸径增量最小时乙烯利和脱落酸浓度之和高于茉莉酸甲酯和6-苄氨基嘌呤之和，而T2处理组中则为盐总浓度最高时（33 mg·g-1），土沉香胸径生长最可能受影响。反之，当脱落酸和乙烯利浓度之和低于茉莉酸甲酯和6-苄氨基嘌呤时，土沉香胸径生长较同组其他处理快。无机盐处理组中，总盐浓度次高时（31 mg·g-1），树体胸径生长最快，此时酸性盐（NaHSO3）浓度降低了一半。所有处理中对土沉香树高影响最小的是葡萄座腔菌菌液处理，而对树高生长影响大的是腐皮镰孢菌液处理，但均未达显著水平，且分别可达对照的76.3%和62.5%。各处理对土沉香冠幅生长无显著影响，对照冠幅增量仅为最低的2号处理的1.13倍。

3.2 不同处理对土沉香醇溶性浸出物含量的影响

醇溶性浸出物的含量是衡量沉香品质的重要指标，《中国药典2020版》及之前各版本药典中的沉香入药标准均为醇溶性浸出物的含量不低于10%。不同处理对土沉香醇溶性浸出物含量有显著影响，各处理醇溶性浸出物含量均显著高于对照（图1）。其中，醇溶性浸出物含量最高的处理为6号处理（NaCl、FeCl2和NaHSO3浓度为1、2.5和5 mg·g-1），醇溶性浸出物含量为13.61%，而对照醇溶性浸出物含量最低，仅为2.00%。各处理醇溶性浸出物含量分别为对照的4.26、5.28、4.76、4.10、4.10、6.81、1.95、3.80、5.72、6.37、5.61和1.51倍。其中2号、6号、9号、10号和11号处理均高于药典标准的10%[21]，其中各处理中尤以真菌菌液处理组的处理数量最多，为3个，而其他2个处理组均只有1个。各处理组中，T1处理组中2号处理最高，显著高于同组中其他处理，其脱落酸和乙烯利的含量均最高，说明土沉香醇溶性浸出物的产生与两者关系更密切。T2处理组中，6号处理显著高于其他3个处理，7号处理显著低于其他3个处理，而处于中间的2个处理（5和8号）醇溶性浸出物含量无显著差异，这可能与6号处理中总盐浓度最低有关，而5号和8号处理中的NaCl浓度相同且FeCl2浓度也高于6号处理，说明氯离子的浓度高时不利于沉香醇溶性浸出物或者沉香物质的形成。真菌菌液处理组中黑绿木霉、腐皮镰孢和葡萄座腔菌3种菌种处理均能有效提高沉香醇溶性浸出物的含量，三者之间无显著差异且均高于药典标准，说明内生真菌生物诱导更有利于土沉香结香。

图1 不同处理土沉香结香部位所提醇溶性浸出物含量Fig.1 Contents of alcohol-soluble extractives extracted from agarwood under different treatments

3.3 不同处理对土沉香最大结香长度和面积的影响

各处理在土沉香树体径向方向扩展量也不尽相同（表2），其中尤以6号处理扩展长度最长，可达75 cm，且为最短处理组（5号）的3倍。各处理组中，4号处理在植物生长调节剂处理组中扩展长度最长，与生长量数据对比发现，4号处理胸径生长量最低，这说明沉香结香生长受抑制，次生代谢增强的抵抗胁迫的过程。无机盐处理组中6号最长，说明较低浓度盐更有利于土沉香物质径向扩展。而真菌菌液处理组中，腐皮镰孢处理最长，但扩散最长处理组仅为最短组的1.6倍，且4个处理扩散长度均超过40 cm，说明真菌处理组促进结香效果较好。

表2 不同处理土沉香结香长度Table 2 The length of agarwood formation under different treatments

沉香树结香后通常包含未结香的白木、腐木和结香层，其中后两者的边界难以确定，通过人工方法无法精确测量结香层的面积，采用荧光光谱成像技术无损地测定土沉香结香面积，可以精确、无损、快速地测定沉香结香面积（图2）。最大结香面积是指同一株土沉香所有截取圆盘中上、下两面变色面积最大的一面所测得的面积。由图3可知，6号处理土沉香最大结香面积是所有处理中最大的，可达199.26 mm2，而对照最小，其树干横截面未变色（0 mm2），其次为10、11、8、9、1、4、12、2、3、7和5号处理。各处理之间差异及变化趋势与沉香醇溶性浸出物含量相似。6号处理土沉香结香面积最大，此处理盐总浓度是4个无机盐处理组中第2低的浓度，说明低浓度（约为1.5 mg·g-1）的无机盐更有利于土沉香结香。

图2 各处理中最大结香面的土沉香木片光谱Fig.2 The spectral image of the maximum agarwood area of A.sinensis trees wood chips in each treatments

图3 不同处理土沉香最大结香面积Fig.3 The maximum agarwood formation area of the A.sinensis trees under different treatments

3.4 不同处理土沉香生长和结香指标相关性分析和综合评价

由图4可知，不同处理土沉香胸径、树高和冠幅等生长量指标之间呈正相关，醇溶性浸出物含量、最大结香面积和结香长度等结香指标亦然，而生长指标和结香指标之间均呈负相关，说明土沉香生长和结香为生长和防御相权衡的结果。由显著性检验结果可知（表3），树高和胸径、冠幅之间呈显著正相关关系，且与最大结香面积和长度显著负相关。最大结香面积和醇溶性浸出物含量、长度之间呈极显著正相关，且与树高、胸径呈显著负相关。树高和最大结香面积可作为衡量土沉香生长和防御（结香）的代表性指标。

图4 不同处理土沉香生长和结香指标相关性Fig.4 Correlation between growth and agarwood formation indexes of A.sinensis trees under different treatments

表3 土沉香生长和结香指标相关性检验值†Table 3 Correlation test values of the growth and agarwood formation indexes of A.sinensis trees

采用主成分分析法计算每个处理土沉香胸径、树高、冠幅、醇溶性浸出物含量、最大结香面积和结香长度综合得分，可以有效评价各处理对土沉香生长和结香的综合影响。由表4可知，不同处理土沉香生长和结香综合表现各异。6号处理得分最高，其后依次为10、8、11、1、4、9、2、12、3、5和7号处理，其中对照（13号）综合得分最低（-8.66分），这也与其结香数量和质量均为最低的结果一致。各处理组中，植物生长调节剂处理组中1号处理得分最高（0.51分），这与其适中的生长量和较大的结香结香面积和长度有关。无机盐处理组中6号处理得分最高（5.43分），这与其醇溶性浸出物含量、最大结香面积和扩散长度的结果一致。而真菌处理组中腐皮镰孢（4.16分）真菌菌液最有利于结香且对树体生长影响最小。排名前5位的处理中，包含了2个真菌处理，是所有处理组中最多的。

表4 不同处理土沉香综合得分Table 4 Comprehensive scores of A.sinensis trees under different treatments

4 讨 论

研究表明，植物生长调节剂与树木生长和代谢均有直接关系。本研究中，3号处理胸径生长量最大，而此时脱落酸和乙烯利浓度之和高于茉莉酸甲酯和6-苄氨基嘌呤之和，反之则反，这是因为前两者是促进树木细胞抵抗胁迫的，而后两者与促进细胞分裂和分化的作用有关[22]。高盐胁迫抑制植物生长，本研究中，高盐浓度处理（8号）在同组中胸径生长量最小，这是因为高盐胁迫导致土沉香树干缺水，使得树干生长量降低[23]。真菌菌液处理组中，葡萄座腔菌菌液处理对白木香胸径生长影响最小，因为该真菌为土沉香树体内生真菌[8]，即使外源施加也不会显著影响树体的正常生长。而注入非土沉香树体内生真菌的龙眼焦腐病菌则加速了土沉香树木质部细胞壁的降解，大大迟滞了土沉香胸径、树高和冠幅的生长[24]。

沉香醇溶性浸出物因其含有种类丰富的次生代谢物，可以应用于化妆品、生活用品和药物等多个产业领域，所以其是一种具有高价值的沉香衍生物[1]。本研究中，当乙烯利和脱落酸浓度远高于茉莉酸甲酯和6-苄氨基嘌呤时，土沉香树体结香部位所提醇溶性浸出物含量最高，这是因为乙烯和脱落酸可能作为信号分子均可以触发抗逆胁迫反应[25]，产生倍半萜、色酮等沉香的特征成分，这些物质都是醇溶性浸出物的主要成分[8]。Zhang等[26]研究表明，火烧孔和冷钻处理后施加适度的盐溶液均能有效提高沉香醇溶性浸出物含量，与本研究中6号表现相同。除龙眼焦腐病菌处理外，黑绿木霉[18]、腐皮镰孢和葡萄座腔菌均可以有效提高土沉香醇溶性浸出物含量，此结果与其他试验的研究结果一致[27]。

土沉香有其独特的内涵韧皮部（或称“木间韧皮部”）[4]，可能有运输和贮藏初生代谢产物的功能[28]。本研究探索性地应用了荧光光谱成像技术，无损测定了土沉香结香数量[20]。结香长度和最大结香面积测定结果一致，说明各种处理在树体中横纵向的扩散量极大相关，这是土沉香生长和防御权衡的有力证明。低浓度酸性盐和葡萄座腔菌处理结香面积和长度值均较大，且这些处理下醇溶性浸出物含量也均较高，说明这些处理处于既能诱导土沉香结香又不影响树体生长的临界点附近，这也与通体结香技术研究结果一致[29]。

植物受胁迫时，生长[30]和光合作用[31]相关基因表达的下调、防御蛋白分泌的增加、碳和氮等优先用于抗逆物质的合成等研究结果表明，植物营养等物质资源从支持生长转向防御胁迫[17]。而本研究中生长和结香（防御）指标负相关的分析结果与上述结论一致。评价不同指标的平衡关系以及综合表现，主成分得分法具有独特的优势。本研究抽取2个主成分，贡献率超过84%，有效地评价了不同处理土沉香生长和结香的综合表现。

本试验分类研究了不同处理对土沉香生长和结香的影响，不同种类、浓度植物生长调节剂和无机盐混合物以及不同种类真菌的复合剂对土沉香生长和结香的影响机制还没有深入研究。研究表明，在真菌菌液中加入适量的酸性盐（NaHSO3等）和植物生长调节剂（脱落酸、6苄基嘌呤等），可能会更高效地促进土沉香结香[18]，但是否能保证树体的高效生长是下一步研究的内容。此外，土沉香结香过程中，树体生长和防御的权衡机制也应该是进一步研究的重点。

5 结 论

12种处理对土沉香胸径生长影响显著，对树高、冠幅的影响未达显著水平，且各处理均能有效提高土沉香醇溶性浸出物含量和结香面积、长度。利用加权系数的主成分得分法计算可得，NaCl、FeCl2、NaHSO3质量浓度为1、2.5和5（总浓度8.5）mg·g-1，植物生长调节剂MeJA、ABA、6-BA、ETH质量浓度为0.01、0.05和0.5 mg·g-1时和腐皮镰孢处理是各处理组中最能有效平衡土沉香生长和结香的处理。综上所述，人工诱导土沉香结香的技术可以促进树体结香，但会减缓树体的生长，所以结香是树体生长和防御相互权衡的结果。