电针水沟穴对脑梗死急性期大鼠血管平滑肌细胞表型标志性蛋白的影响

陈林玲,韩佳炜,殷秀梅,秋 添,武家竹,杜元灏△

(1.天津中医药大学第一附属医院,天津 300381;2.国家中医针灸临床医学研究中心,天津 300381;3.浙江中医药大学第五临床医学院 湖州市中心医院,浙江 湖州 313000;4.吉林大学第一医院,吉林 长春 130021)

脑梗死是我国成人致死、致残的首要病因,其发病率、致死率、致残率及复发率高,患病人群趋于年轻化,且会导致患者经济负担重,其中急性脑梗死占脑梗死的60%～80%[1]。国内外治疗主要是通过及时再灌注以恢复脑血流量,挽救缺血的组织,降低残疾率[2]。尽管再灌注可产生损伤,但利大于弊,改善脑循环仍是治疗脑梗死的关键环节之一。血管平滑肌细胞的功能是通过舒缩调节血管的张力,其可塑性强,在血管病变部位,血管平滑肌细胞可由收缩型转化为合成型,当血管修复完成后,血管平滑肌细胞又可转化为非增殖性的收缩型。因此,研究血管平滑肌细胞的功能和形态对脑梗死的治疗至关重要。

（2）从中国的出口商品结构看，改革开放40年来，中国出口商品的结构由原料和工业半成品为主逐渐转为机电设备、通信技术设备等科技产品为主，而此类产品具有低成本高利润的特点，无形中对美国同类产品形成竞争。因此，美国的厂商想方设法利用“337条款”夺回失去的市场份额。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SPF级Wistar大鼠60只,由斯贝福(北京)生物有限公司提供[许可证号:SCXK(京)2019-0010],5～6周龄,体质量190～210 g。随机分为空白组、假手术组、模型组和电针组,模型组和电针组又按术后3 h、6 h、24 h与72 h分为4个时相,每个时相6只,空白组和假手术组各6只,所有大鼠均适应性喂养1周后开始实验。实验过程中,大鼠饲养所需的饲料和水、饲养环境(温度、湿度与光照)等各个环节均符合南开医院动物实验中心的相关规定。术前12 h禁食。实验过程中对动物的处置严格遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂与器材

1.2.1 试剂 一抗Rabbit Anti-phospholamban antibody(Bioss);Rabbit Anti-MGP Polyclonal antibody(proteintech);二抗兔二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司);异氟烷(北京友诚生物科技有限公司);DAB(北京中杉金桥生物有限公司);哺乳动物总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉博士德生物工程公司)。

学生在做该题时、易错点为：对5L不知如何处理、代数据时就是5L、不知道用把5L水的质量算出来、还有的学生就只算出水吸收的热量。所以做题时、要认真审题、还要学会把前后知识连贯应用起来。

1.2.2 仪器 手术器械(上海精密仪器厂);一次性使用无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司);韩氏电针仪(北京华运安特科技公司),HVE-50自动高压灭菌器(Hirayama);GZX-DH电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂);小动物专用吸入麻醉机(Matrx);脱水机(DIAPATH);包埋机(武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);脱色摇床(武汉赛维尔生物科技有限公司);显微镜(日本尼康);超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技公司);DYCI-24DN小型垂直电泳槽、多功能成像仪(德国Analytikjena AG)。

Western-blot检测结果显示:空白组与假手术组大鼠大脑中动脉PLN蛋白表达差异比较无统计学意义(P>0.05),模型组与电针组大鼠大脑中动脉PLN蛋白表达在MCAO后3 h即开始呈现下降趋势,24 h降至最低点,随后稍有回升,模型组与空白组和假手术组比较,在24 h和72 h差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),电针组与假手术组比较,在24 h和72 h差异具有统计学意义(P<0.05),电针组与模型组大脑中动脉PLN蛋白表达差异比较无统计学意义(P>0.05);空白组与假手术组大鼠大脑中动脉MGP蛋白表达差异比较无统计学意义(P>0.05),模型组与电针组大鼠大脑中动脉MGP蛋白表达在 MCAO后3 h即开始呈现上升趋势,24 h升至最高点,随后稍有下降,与空白组和假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),电针组各时相MGP蛋白表达水平均低于同时相模型组,在6 h差异比较具有统计学意义(P<0.05)见图3和表4～5。

1.3 MCAO模型制备与干预方法

1.5.3 WB法定量检测大鼠血管平滑肌细胞表型标志性蛋白PLN、MGP表达 将-80 ℃冰箱保存的血管取出,提取总蛋白,BCA蛋白定量,根据目标蛋白的分子量大小配置 SDS-PAGE凝胶,每孔上样10 μL,电泳1.5 h,随后进行转膜2 h,用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h后,将膜转移至含PLN一抗(1∶300)、MGP一抗(1∶400)及GAPDH一抗(1∶10 000)的封闭液中,室温孵育0.5 h后4 ℃过夜。TBST洗膜10 min×3次后加入相应的二抗(1∶5 000),室温摇床1 h后洗膜,采用ECL化学发光液进行显影。运用ImageJ软件处理并分析目标条带与内参条带的吸光度值,以目标条带与内参条带的比值作为蛋白相对表达量。

1.4 取材

造模前,纳入实验的大鼠NSS评分均为0分;假手术组NSS评分为0分;模型组及电针组在3 h后均出现NSS评分最高分,随着缺血时间延长,NSS评分逐渐下降。各时相模型组、电针组与空白组、假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);电针组各时相NSS评分均小于同时相模型组,在72 h比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

1.5 观察指标及检测方法

必须强调的是，学生分层应该是一种隐性分层。或者说，教师在实施分层时，应充分把握分层给学生带来的心理影响，避免挫伤学生的自尊心，造成学生对自身的消极定位。苏霍姆林斯基认为，“有差异的学生之间的相互作用能产生互补以及教学的生长力和助推力”[3]。因此，教师应以积极鼓励的态度展开教学分层，并让学生意识到水平互异的每个个体在集体中的作用是平等且不可或缺的。

1.5.2 免疫组化定性检测大鼠血管平滑肌细胞表型标志性蛋白PLN、MGP表达 将固定于多聚甲醛的血管取出,包埋、石蜡切片,脱蜡至水,抗原修复,将切片放入3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶,随后血清封闭、加入PLN一抗(1∶150)、MGP一抗(1∶200)二抗,DAB显色,苏木素复染、脱水封片,显微镜下高倍镜视野(400×)采集图像。苏木素染细胞核为蓝色,DAB显出的阳性表达为棕黄色。采用Image-pro plus 6.0病理图像分析系统对阳性表达进行分析,以平均光密度(AOD)代表蛋白相对表达量。

参照Zea longa[3]的腔内线栓法并进行改良后阻滞大鼠的右侧大脑中动脉,大鼠经异氟烷麻醉后自右侧颈总动脉向颈内动脉插入线栓,制备永久性大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。假手术组大鼠除不插入线栓外,其余步骤相同。电针组在MCAO后即刻针刺水沟穴(GV26),定位参照1991年华兴邦主编的《大鼠穴位图谱》[4]及《实验动物常用穴位名称与定位第2部分:大鼠》[5],用0.25 mm×25 mm的一次性无菌针灸针在大鼠鼻尖下1 mm正中处向上斜刺2 mm,并在该部位下约2 mm处刺入一针作为参考电极,水沟穴接电针仪的正极,参考电极接负极,用15 Hz、2 MA的疏密波电刺激,持续针刺20 min。3 h、6 h与24 h组针刺1次,72 h组每日针刺1次,模型组、假手术组和空白对照组均同样抓取固定,但不进行任何治疗。

1.6 统计学处理

免疫组化法检测结果显示:PLN广泛表达于大脑中动脉中膜层的血管平滑肌细胞中。空白组与假手术组PLN阳性表达无统计学意义(P>0.05);电针组与模型组大鼠大脑中动脉PLN阳性表达在MCAO后3 h即开始呈现明显下降趋势,与空白组和假手术组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01),随着梗死时间延长,模型组继续呈缓慢下降趋势,与空白组和假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);电针组在6 h表达稍微有所上调,随后呈缓慢下降趋势,与空白组和假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),但电针组各时相大脑中动脉PLN阳性表达均高于同时相模型组水平,与同时相模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。图1和表2。

2 实验结果

2.1 各组大鼠NSS评分情况

根据实验分组,在对应时间点将大鼠断头取脑,迅速剥离出脑组织,将其置于冰袋上,分离剪取右侧大脑中动脉8 mm左右(以大脑中动脉从Willis环分出处为起点,沿其循行8 mm处为剪取终点),3只大鼠大脑中动脉置于4%多聚甲醛固定液中进行固定备用,剩余3只置于液氮速冻后-80 ℃冰箱保存备用。

表1 各组大鼠取材前NSS评分结果

2.2 各组大鼠血管平滑肌细胞PLN阳性表达情况

注:B.空白组;S.假手术组;M3h.3 h模型组;M6h.6 h模型组;M24h.24 h模型组;M72h.72 h模型组;A3h.3 h电针组;A6h.6 h电针组;A24h.24 h电针组;A72h.72 h电针组。图1 各组大鼠大脑中动脉PLN免疫组化染色图(400×)

表2 免疫组化法检测各组大鼠大脑中动脉PLN阳性表达情况

2.3 各组大鼠血管平滑肌细胞MGP阳性表达情况

免疫组化法检测结果显示:MGP广泛表达于大脑中动脉中膜层的血管平滑肌细胞中。空白组与假手术组MGP阳性表达无统计学意义(P>0.05);电针组与模型组大鼠大脑中动脉MGP阳性表达在MCAO后3 h即开始呈现明显上升趋势,与空白组和假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),随梗死时间延长,模型组在6 h稍有下降后继续呈缓慢上升趋势,与空白组和假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);电针组一直呈缓慢上升趋势,与空白组和假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),但电针组各时相大脑中动脉MGP阳性表达均低于同时相模型组水平,与同时相模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见图2和表3。

1.5.1 神经功能缺损评分(Neurological severity scores,NSS) 参照Jieli Chen等[6]的评分方法,各组大鼠于术前、术后及取材前进行NSS评分,最低0分,最高18分,评分越高损伤越重。1～6分为轻度损害,7～12分为中度损害,13～18分为重度损害。NSS评分≥2视为造模成功。

注:B.空白组;S.假手术组;M3h.3 h模型组;M6h.6 h模型组;M24h.24 h模型组;M72h.72 h模型组;A3h.3 h电针组;A6h.6 h电针组;A24h.24 h电针组;A72h.72 h电针组。图2 各组大鼠大脑中动脉MGP免疫组化染色图(400×)

表3 免疫组化法检测各组大鼠大脑中动脉MGP阳性表达情况

2.4 各组大鼠血管平滑肌细胞PLN、MGP蛋白表达比较

从回归效果看，0.653为决定系数，0.636为调整决定系数，商品配送价格等五个影响因素共解释了网购物流配送客户满意度59.13%的方差，F=103.342，达到了非常显著的水平。所有各项的t检验值结果良好，包括常数项在内，均应出现在回归方程中。采用普通回归系数，回归方程为：物流配送客户满意度=A×0.113+B×0.117+C×0.198+D×0.215+E×0.163-4.602，其中回归标准化残差标准图如图，也表明回归过程中拟合效果较好，得到较好的回归效果。

注:B.空白组;S.假手术组;M3h.3 h模型组;A3h.3 h电针组;M6h.6 h模型组;A6h.6 h电针组;M24h.24 h模型组;A24h.24 h电针组;M72h.72 h模型组;A72h.72 h电针组。图3 各组大鼠大脑中动脉PLN、MGP蛋白表达条带

表4 各组大鼠大脑中动脉PLN蛋白相对表达量

表5 各组大鼠大脑中动脉MGP蛋白相对表达量

3 讨论

血管不是一个简单的管道系统,而是具有舒缩运动和复杂分泌功能等重要机能的整合性器官,尤其是微血管系统具有自律运动,为血液进行第二次赋能,被称为“第二心脏”作用,因此脑血管的机能状态也是决定脑循环的重要因素。血管损伤后,血管平滑肌细胞表型会发生转化,由收缩型转变为合成型,进而引起细胞的增殖和迁移,导致血管重构。因表型转化引起的血管肥大、内膜增厚及斑块等改变是心脑血管疾病发生发展的病理基础[7]。因此,血管结构和功能的自稳态平衡是机体生命活动的重要基础,在维持机体的正常生理功能中发挥重要作用。研究发现有些基因表达产物在细胞表型转化中有相同的增减变化[8]。这些基因表达产物就可作为平滑肌细胞表型状态的标志物,例如,收缩型标记物主要有肌球蛋白重链、a肌动蛋白、调宁蛋白和受磷蛋白,合成型标记物主要有骨桥蛋白、表皮调节素和基质Gla蛋白等[9-11]。

小朋友通常喜欢颜色鲜艳的东西，认为色彩斑斓的书包很漂亮。不过，这类书包在印染的过程中可能会加入更多重金属等有害物质。此外，为了规避游离甲醛对身体的伤害，你在购买书包时还需要闻闻书包的气味。如果书包的气味特别重，说明它可能含有对人体有害的刺激性气体和超标物质，最好不要购买。

受磷蛋白(Phospholamban,PLN)存在单链和五聚体两种结构,单链由52个氨基酸组成,五聚体由5个相同的单体组成,主要在心肌、平滑肌等细胞的内质网中表达。PLN在心血管疾病中研究甚广,在脑血管系统疾病中鲜有研究。PLN的胞质结构域中具有3个磷酸化位点,包括:Ser10、Ser16和Thr17,这些位点对于调节Ca2+的存储至关重要[12],众所周知心肌的收缩和舒张依赖Ca2+循环的正常进行,Ca2+循环受SERCA2a酶活性的影响,SERCA2a酶活性又受受磷蛋白的调节,研究显示磷酸化PLN可以抑制PLN与SERCA2a之间的结合,从而提高SERCA2a对Ca2+的亲和力[13]。众多研究表明心力衰竭或心肌病时,PLN蛋白水平降低[14-15]。而在房颤发生时,PLN的mRNA表达增多[16]。本研究结果表明空白组与假手术组PLN阳性表达及蛋白表达相当,处于较高水平,模型组在MCAO后3 h即开始呈下降趋势,蛋白表达在72 h稍有回升;电针组PLN阳性表达量也是在MCAO后3 h呈下降趋势,虽然在6 h稍有回升,随后继续呈下降趋势;电针组PLN蛋白表达呈缓慢下降趋势,但电针组各时相大脑中动脉PLN阳性表达及蛋白表达均高于同时相模型组水平,其PLN阳性表达量与同时相模型组比较有统计学意义(P<0.01),蛋白表达与模型组比较无统计学意义(P>0.05),说明脑梗死急性期,大脑中动脉平滑肌细胞表型出现异常,从收缩表型向合成表型转化,伴随着收缩表型标志物PLN的表达下降,这与心肌损伤研究结果类似,但由于本实验时相为脑梗死急性期,未能探明电针组与模型组PLN蛋白表达在急性期有显著性差异,期待进一步延长时相做进一步的探讨。

基质Gla蛋白(Matrix gla protein,MGP)是一种维生素K依赖性蛋白,其含有5个γ-羧基谷氨酸残基,含有磷酸化的丝氨酸残基,可能进一步调节其活性[17],MGP在骨和许多其他间充质细胞中合成,也在血管平滑肌细胞和软骨细胞中高度表达。目前关于MGP研究较多的主要是血管钙化、动脉粥样硬化、骨质疏松、恶性肿瘤、慢性肾脏病和溃疡性结肠炎等[18-22]。李勇等[21]探讨血清MGP水平与冠状动脉钙化程度相关性进行,结果表明血清MGP水平与冠脉钙化程度呈负相关。 Schurgers LJ等[17]用人的血管平滑肌研究表明,MGP可能通过结合VSMC细胞表面囊泡来抑制钙化。20世纪末有研究显示[23]大鼠动脉内膜损伤后血管内MGP的mRNA表达水平逐渐升高,21 d后开始下降,本研究结果与其类似。本研究结果表明空白组与假手术组MGP阳性表达及蛋白表达相当,处于较低水平,电针组和模型组大鼠大脑中动脉MGP阳性表达和蛋白表达在MCAO后3 h开始上升,模型组阳性表达在6 h稍有下降后继续呈缓慢上升趋势,蛋白表达在24 h升至最高点,72 h稍有回落;电针组阳性表达一直呈缓慢上升趋势,且各时相MGP阳性表达水平均低于同时性模型组,与同时相模型组差异比较有统计学意义(P<0.01),电针组蛋白表达趋势与模型组类似,且各时相蛋白表达水平均低于同时相模型组,与模型组比较在6 h差异比较有统计学意义(P<0.05)。

综上,脑梗死急性期,脑表面的动脉血管平滑肌细胞表型出现严重异常,表现为从收缩表型向合成表型的大量转化,伴随着收缩表型标志性蛋白PLN的表达下降,而合成表型标志性蛋白MGP异常高表达,电针人中穴可显著抑制血管平滑肌细胞表型的异常转化,从而稳定了血管平滑肌细胞的表型状态,使脑血管处于以收缩表型为主的正常状态,有利于保持其舒缩运动功能,为脑梗死后代偿血流提供了条件。