基于网络药理学和分子对接探究药膳“枸杞-桑椹-覆盆子汤”治疗糖尿病肾病的分子机制

任晨汐，卞灿锋，李 宁，高 雅，张玉霞，胡 钦，肖丽霞，关天竺,*

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225009；2.吉林大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130062）

糖尿病肾病是以持续性蛋白尿、血压升高以及肾功能下降为主要特征的疾病，是糖尿病常见慢性并发症之一，在我国的发病率呈上升态势，已成为终末期肾脏病的主要原因[1-2]。众多研究表明，糖尿病肾病发病原因极为复杂，至今仍未完全阐明，机体在糖尿病肾病的特殊环境下，免疫细胞、转录因子、促炎细胞因子、趋化因子和自身抗体等免疫因素相互影响，造成肾功能的损害，而其中氧化应激反应是参与糖尿病肾病启动和发展的重要环节之一，即过量的活性氧作用于各种细胞因子和转录因子，抑制抗氧化酶的表达，最终导致糖尿病肾病肾组织中相关应激损伤的发生进程[3-4]。2019年国际糖尿病联盟发布的数据表明：全球20～79 岁成人糖尿病患者约4.63 亿人，其中20%～40%的患者患有糖尿病肾病，可见糖尿病肾病的高患病率已成为世界性的重大公共卫生问题[5-6]。随着糖尿病肾病研究的不断深入，基于药食同源、中药材中的活性成分在基于多靶点协同作用及缓解氧化应激进程等改善肾脏病变作用越来越受到人们的关注[7]。

药膳是指采用现代科学技术加工方法，将不同药食同源材料进行合理组方配伍并制作成具有保健防病作用的特殊膳食[8]。《食疗本草》作为现存最早的一部药膳学专著，其推崇的“药食同源、医食同源”的思想，对药膳的发展起到了推动作用[9]。从中医视角看，枸杞滋肝补肾，桑椹补肾养肝，覆盆子固精缩尿益肝肾[10]。因此，在民间早有在“大寒”时煮制“枸杞-桑椹-覆盆子汤”的悠久历史与传统。近年来，大量体内或体外研究表明，枸杞、桑椹和覆盆子中的活性成分可用于治疗糖尿病肾病，如李菁菁等[11]通过研究枸杞多糖对糖尿病肾病兔子肾功能的影响证实枸杞多糖能够明显延缓肾脏损伤。谢欣梅等[12]研究发现，覆盆子中的活性成分覆盆子酮可增加胰岛素分泌，具有剂量依赖性的降血糖效果。Chen 等[13]证明了桑椹提取物对糖尿病小鼠具有显著的降糖与多种活性功能。各方面皆表明药膳“枸杞-桑椹-覆盆子汤”对于糖尿病肾病有潜在治疗效果，但具体作用机制尚不明确。因此，本文遵循平衡阴阳、扶正驱邪、三因制宜等应用原则[14]，以“枸杞-桑椹-覆盆子”为药膳方研究其在糖尿病肾病中的应用。

药膳在多成分、多靶点、多通路的多因素复杂疾病方面具有独特优势，但目前其活性成分与人体内潜在作用机制尚不明确，因此难以从“整体-细胞-分子”水平进行全面的理论研究[15]。网络药理学作为以系统生物学和大数据技术为理论基础的学科，可通过网络生物学、生物信息学、系统生物学等多角度对相关疾病的形成与发展进行解释，广泛应用于中药组方与新兴药理学，具备“疾病-靶向基因-活性成分”多角度与多层次的特点，这也与食品领域中食疗药膳潜在作用机制研究的内核十分契合，因此具有发展潜力与优势[16-17]。利用药膳在多维视角上干预糖尿病肾病的氧化应激途径，不仅具有适用范围广、可操作性强、接受度高等独特优势，更对药膳进行基础与理论研究具有重要意义。本研究利用网络药理学、分子模拟与体外抗氧化方法，研究了药膳“枸杞-桑椹-覆盆子汤”防治糖尿病肾病的潜在机制，以期为糖尿病肾病的食疗开发与后续研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

桑椹、枸杞、覆盆子：江苏扬州联谊农副产品批发市场；2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（98%）、L-抗坏血酸（≥99%）、硫酸亚铁（90%无水）、水杨酸（HPLC≥98%）、H2O2（30%水溶液）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.1.2 仪器与设备

1-14K 型离心机：北京博劢行仪器有限公司；DHG-9076A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验（太仓精宏仪器）设备有限公司；SS-1022型高速多功能粉碎机：武义海纳电器有限公司；KQ5200 型超声机：昆山市超声仪器有限公司；Infinite F50酶标仪：帝肯（上海）贸易有限公司；UV-6100S型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药膳的活性成分及预测靶点收集

运用中药系统药理学平台（Traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）（https://old.tcmspp-e.com/tcmsp.php/）分别检索“枸杞-桑椹-覆盆子汤”中3 味药食同源材料，以枸杞子（Lycii fructus）、桑椹（Mori fructus）、覆盆子（Rubi fructus）为关键词初步获取化学成分数据，同时对文献中报道的活性成分进行补充[18-21]。由于“枸杞-桑椹-覆盆子汤”属于口服方剂，因此以口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和类药性指数（Drug-likeness,DL）≥0.18为筛选条件分别确定活性化学成分。然后通过检索TCMSP数据库获取对应的靶点信息，通过将蛋白质数据库（Uniprot）（http://www.uniprot.org/）限定物种为“Homo sapiens”后，对上述靶点名称进行标准化。

1.2.2 糖尿病肾病相关靶点筛选

分别在GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https://omim.org/）、TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）和DisGeNET 数据库（http://www.disgenet.org/search）中以“diabetic kidney disease”为关键词，搜索糖尿病肾病相关基因，获得糖尿病肾病的潜在靶点。

1.2.3 “活性成分-疾病靶点”网络图的绘制

利用Cytoscape 3.8.0 构建“活性成分-疾病靶点”调控网络，其中节点代表关键化合物和靶点，边代表节点之间相互作用的关系。

1.2.4 基于交集靶点的互作网络构建

将获得的有效成分与糖尿病肾病的共同靶点导入STRING 11.0（https://cn.string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，构建“枸杞-桑椹-覆盆子汤”治疗糖尿病肾病共同靶点的PPI网络，同时对交集靶点间的相互作用关系进行可视化分析。

1.2.5 核心团簇及关键靶点筛选

利用Cytoscape 中MCODE 插件对交集靶点进行聚类分析，选取网络中关系最为紧密的核心团簇（Core cluster）。然后利用CytoHubba 插件，对核心团簇进行拓扑学相关分析，根据网络拓扑参数介度中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）和借助度中心性（Degree）分别进行关键靶点逐层筛选。

1.2.6 交集基因的基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

将共同基因靶点通过DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行在线基因ID转换，并对共同靶点进行生物学过程（Biological process，BP）、细胞成分（Cellular component，CC）及分子功能（Molecular function,MF）的GO注释分析和KEGG通路富集分析，以校正后P值小于0.05为条件进行“枸杞-桑椹-覆盆子汤”中治疗糖尿病肾病生物学过程和信号通路的分析。

1.2.7 分子对接

分别从PubChem 数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB 蛋白质结构数据库（https://www.rcsb.org/）获取初始的活性化学分子和靶点蛋白的3D结构文件。使用AutoDock Tools 1.5.6 软件进行去水加氢，采用AutoDock Vina进行核心靶点-活性成分分子对接，计算最低结合能，最后利用PyMol 对蛋白与分子结合模式进行可视化分析。

1.2.8 抗氧化活性测试

1.2.8.1 “枸杞-桑椹-覆盆子汤”抗氧化物质提取

将组方“枸杞-桑椹-覆盆子”于60 ℃烘箱内烘干，粉碎后过120 目筛，按料液比1∶10（g/mL）加入无水乙醇，然后置于50 ℃、超声功率300 W条件下提取30 min，再以8 000 r/min离心20 min，取上清液为待测液。

1.2.8.2 DPPH自由基清除率的测定

精确移取0.1 mL质量浓度分别为20、40、60、80、100 mg/mL 的VC 标准溶液或提取样液，与5.0 mL 浓度为0.16 mmol/mL的DPPH乙醇溶液混合均匀，于避光处静置30 min。取上清液于517 nm条件下测定吸光度值，记为A1；用无水乙醇代替VC 标准溶液或样液，测定517 nm 处的吸光度值，记为A0；用无水乙醇代替DPPH 自由基溶液，测定517 nm 处的吸光度值，记为A2。通过以下公式[22]计算DPPH自由基清除率。

1.2.8.3 羟基自由基清除率的测定

在比色管中加入1 mL硫酸亚铁溶液（9 mmol/mL）、1 mL水杨酸的无水乙醇溶液（9 mmol/mL）、1 mL质量浓度分别为20、40、60、80、100 mg/mL的VC标准溶液或提取样液、1 mL过氧化氢溶液（8.8 mmol/mL），然后摇匀，在37 ℃下反应30 min，于510 nm处测定吸光度值，记为A1；用1 mL 蒸馏水代替样液，测定510 nm 处吸光度值，记为A0；用1 mL 蒸馏水代替过氧化氢溶液，测定510 nm 处吸光度值，记为A2。通过以下公式[23]计算羟基自由基清除率。

1.2.8.4 ABTS阳离子自由基清除率的测定

按ABTS试剂盒要求将ABTS原液和氧化剂按1∶1混合后于4 ℃冰箱避光反应16 h 后制成ABTS 母液，将其稀释至在734 nm处吸光度值为0.700±0.020。移取2 mL 质量浓度分别为20、40、60、80、100 mg/mL 的VC 标准溶液或提取样液，加入2 mL ABTS 工作液混合均匀，室温避光反应20 min，于波长734 nm处测定吸光度值，记为A1；用1 mL 蒸馏水代替样液，测定734 nm 处吸光度值，记为A0；用1 mL 蒸馏水代替ABTS溶液，测定734 nm处吸光度值，记为A2。ABTS+自由基清除率计算公式[24]如下：

1.2.9 数据处理

采用SPSS 20.0 软件对所有试验数据进行分析，数据结果以¯x±s表示。采用单因素方差分析进行统计学分析，以确定两组之间的差异是否具有显著性。

2 结果与分析

2.1 药膳“枸杞-桑椹-覆盆子汤”活性成分及活性成分靶点的筛选

通过TCMSP数据库检索到已报道的活性成分共392个，其中枸杞子189个、桑椹91个、覆盆子112个。经去重并以DL≥0.18，OB≥30%为条件进行筛选后，共得到有效化学成分55个。同样基于TCMSP数据库的靶点预测，对预测所得作用靶点汇总去除重复项后通过UniProt数据库进行基因名标准化，共得209个成分对应靶点。

2.2 糖尿病肾病相关靶点的获取

如图1A 所示，通过GeneCards、OMIM、TTD、Dis-GeNET数据库检索出糖尿病肾病的作用靶点分别为273 个、252 个、27 个和206 个。剔除重复项后，共得糖尿病肾病的作用靶点641 个。如图1B 所示，将糖尿病肾病作用靶点与208 个活性成分作用靶点取交集，得65个共同靶点。由此可初步推测，药膳“枸杞-桑椹-覆盆子汤”通过“多成分-多靶点”网络作用于糖尿病肾病。

图1 药膳与糖尿病肾病靶点预测图Fig.1 The prediction diagram of medicated diet and diabetic kidney disease targets

2.3 “活性成分-疾病靶点”网络图分析

如图2 所示，将药食同源材料、分子活性成分和65 个共同靶点导入Cytoscape 3.8.0 软件中，构建“活性成分-糖尿病肾病共同靶点”可视化网络。其中：多边形为经筛选后的活性分子成分，而长方形代表靶点。通过对可视化网络的总体特征进行分析发现，55 个活性成分中存在一个活性成分对应多个靶蛋白的情况，也存在多个活性成分对应同一个靶蛋白的情况，表明“枸杞-桑椹-覆盆子”具备多活性成分、多靶标的作用特点[25]。

图2 “枸杞-桑椹-覆盆子汤-活性成分-糖尿病肾病共同靶点”可视化网络Fig.2 Visualization network of‘Chinese wolfberry-mulberry-raspberry decoction-active ingredient-diabetic nephropathy co-targets’

2.4 PPI网络构建与核心靶点筛选

为了进一步了解活性化合物作用靶点与糖尿病肾病相关蛋白间的交集蛋白的相互作用关系，构建交集靶点的相互作用网络。如图3 所示，共获得64个节点和1 040 个相互作用（边），经MCODE 进行核心团簇分析后得到两个核心团簇。其中：核心团簇1（图3B）为3 个节点和3 个相互作用（边）；核心团簇2（图3C）为43个节点和742个相互作用（边）。

图3 交集靶点PPI及核心簇分析Fig.3 PPI network of intersection targets and core cluster analysis

如图4所示，在上述核心团簇中分别以介度中心性、接近中心性和借助度中心性为指标，共筛选出5个核心靶点，分别为白介素6（IL6）、人白介素-1β（IL1B）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）、基质金属蛋白酶9（MMP9）和血管内皮生长因子A（VEGFA），这些靶点在PPI 网络中占有重要地位，推断它们是药膳治疗糖尿病肾病的关键靶点。

图4 “枸杞-桑椹-覆盆子汤”核心靶点筛选Fig.4 Identification of hub genes of Sanzi decoction

2.5 GO富集分析

如图5 所示，GO 富集分析进一步解释了“枸杞-桑椹-覆盆子汤”治疗糖尿病肾病的潜在机制。交集靶点经富集分析后可以看见这些核心靶点以交互且复杂的网络态发挥作用，并非独立作用。基因表达的正调控（Positive regulation of gene expression）、DNA模板的转录正调控（Positive regulation of transcription,DNA-templated）、凋亡的负反馈（Negative regulation of apoptotic process）、药物反应（Response to drug）、衰老（Aging）等生物学过程在参与糖尿病肾病的调控中起到主要作用；细胞组分集中于血小板颗粒腔（Platelet alpha granule lumen）、胞质成分（Cytosol）、细胞质（Cytoplasm）、质膜（Plasma membrane）、细胞外间隙（Extracellular space）等；而分子功能富集于蛋白结合（Protein binding）、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡的执行阶段（Cysteine-type endopeptidase activity involved in execution phase of apoptosis）、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程（Cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、同源蛋白结合（Identical protein binding）、酶结合（Enzyme binding）等，如核心靶点之一的PPARG 可与内源性配体发生广谱性结合，形成复合物，进而使受体发挥系列生物学效应[26-27]。此外，CASP3作为半胱氨酸蛋白酶的重要成员，可通过半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程作用于糖尿病肾病的调控[28-29]。

图5 交集靶点GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of the intersection targets

2.6 KEGG富集分析

通路分析在系统药理学中起着至关重要的作用，它不但可以通过将数千个基因蛋白分组到几百条通路中来降低功能分析的复杂性，而且可以增加解释效率。如图6 所示，按-lgP由大到小排名，取前10绘制KEGG 通路富集分析气泡图，图中气泡越大，代表富集到本通路的基因越丰富，进而表示在此通路发挥的作用也越明显且重要。通过KEGG 通路富集共得到214条通路，其中排名靠前的相关通路为癌症途径（Pathways in cancer）、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、癌症中蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）和缺氧诱导因子1 信号通路（HIF-1 signaling pathway），它们以发挥协同作用来治疗糖尿病肾病。其中，AGE-RAGE通路可以激活NF-κB，以及通过激活NADPH 氧化酶导致NF-κB活化，最终导致细胞活化及组织损伤，并可使这一过程重复而致恶性循环；另可通过刺激血管内皮生长因子造成血管通透性增加，进一步导致蛋白尿的产生[30-31]。此外，Fluid shear stress and atherosclerosis 通路是抑制炎症、血管舒张、抗动脉粥样硬化的主要途径[32]。这些信号通路在糖尿病肾病的发生和发展中起核心作用，表明“枸杞-桑椹-覆盆子汤”可能作用于这些信号通路，进而发挥对糖尿病肾病的治疗作用。

图6 交集靶点KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathpay enrichment analysis of the intersection targets

2.7 分子模拟

选择活性成分-靶点调控网络中含最多相关靶基因的有效活性蛋白为对接配体。选择交集基因拓扑分析的核心基因：IL6、IL1B、PPARG、MMP9、VEGFA共5 个，分别与活性成分β-谷甾醇（MOL000358：Beta-sitosterol）、大豆黄素（MOL008400：Glycitein）、桑色素（MOL000737：Morin）、槲皮素（MOL000098：Quercetin）、β-胡萝卜素（MOL002773：Beta-carotene）和鞣花酸（MOL001002：Ellagic acid）进行分子对接。使用AutoDock Vina 软件进行分子对接，并计算各个蛋白与小分子配体的最低结合能，如图7 所示，结合能小于0 kcal/mol 代表复合物可进行自发结合，结合能越小，结合能热图越接近红色，构象越稳定。在本研究中，全部活性靶点与关键化学成分间的结合能均小于-5 kcal/mol，说明靶点与成分间不但能自发结合，更表现出较强的亲和力，进一步从理论计算的角度验证了“枸杞-桑椹-覆盆子汤”中“多活性成分-多靶点”的特点。

图7 关键成分与作用靶点的分子对接结合能热图Fig.7 The heatmap of molecular docking binding energy between hub compounds and action targets

图8 为核心蛋白与活性成分相互作用的2D 和3D 示意图，图中所示为5 个关键靶点与对应活性成分形成的结合能最强的复合物，复合物及结合能分别为：IL6-Glycitein（-8.7 kcal/mol），PPARG-Quercetin（-8.9 kcal/mol），IL1B-Ellagic acid（-6.7 kcal/mol），MMP9-Beta-sitosterol（-7.3 kcal/mol），VEGFA-Betasitosterol（-6.1 kcal/mol）。槲皮素是广泛存在于多种植物中的天然黄酮类化合物，且与本研究中所有核心靶点皆有较强的亲和力（结合能＜-5 kcal/mol）。如图8E 所示，槲皮素与PPARG 形成了以Carbon hydrogen bond、Alkyl、Pi-Alkyl 和Pi-Sigma 等作用力共同驱动的复合物，结合能达-8.9 kcal/mol，说明槲皮素在“枸杞-桑椹-覆盆子汤”中的活性作用显著，具有很大的应用潜力。此外，β-谷甾醇作为植物甾醇的一种，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗肿瘤等作用[33-35]，同样与本研究中的核心靶点具有相当广谱的亲和力（结合能＜-6 kcal/mol）。PPARG 是一种重要的细胞分化转录因子，属过氧化物酶体增殖物激活受体家族中的一个亚型，研究表明，高糖可导致肾小管上皮细胞内PPARG表达的下调[36]。而本研究中的6 种活性成分均与PPARG 呈稳定的结合构象，其中β-谷甾醇、槲皮素与鞣花酸分别与PPARG 呈较高的亲和力（结合能＜-8 kcal/mol）。同样，血管内皮生长因子（VEGF）的异常表达与糖尿病肾病的发病密切相关。在糖尿病肾病早期，VEGF 的表达显著增多，从而引起进展性蛋白尿、肾小球塌陷，导致肾功能衰竭。而血管内皮生长因子A（VEGFA）作为最主要的血管内皮生长因子，主要表达于肾小球足细胞、远端肾小管和集合管，对维持肾小球滤过屏障的完整性和足细胞活性有重要意义[37]。分子对接结果显示，“枸杞-桑椹-覆盆子汤”的核心活性成分可以很好地与主要潜在靶点结合，验证了活性成分治疗糖尿病肾病的可能性。

图8 关键成分与作用靶点的结合模式图Fig.8 Binding pattern of hub compounds and action targets

2.8 抗氧化指标测定

如图9 可知，“枸杞-桑椹-覆盆子汤”提取物对DPPH 自由基清除率均随着质量浓度的升高而逐渐增大。提取物质量浓度为20 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为47.92%，对ABTS阳离子自由基的清除率为58.58%，对羟基自由基的清除率为36.60%；在质量浓度为100 mg/mL 时，对DPPH 自由基的清除率可达76.78%，对ABTS 阳离子自由基的清除率为84.02%，对羟基自由基的清除率为67.70%。研究表明，糖尿病肾病的发病机制是由多因素共同决定的，体内氧化剂与抗氧化剂之间的失衡与糖尿病肾病发展存在密切联系。杨晓曦等[38]研究表明，芡实醇提物可作为备选的自由基清除成分，其不仅具有降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白的作用，更具有较强的抗氧化能力。同样，崔丹丹[39]通过体外抗氧化与体内模型验证表明，罗汉果多糖具有较强的抗氧化能力与减轻肾脏负荷、损伤的作用，可以减轻糖尿病肾病相关症状，因此对氧化应激的抑制可作为治疗糖尿病肾病的一种可行性方法。本研究结果表明，“枸杞-桑椹-覆盆子汤”提取物对DPPH 自由基、羟基自由基和ABTS 阳离子自由基均具有较强的体外抗氧化能力，该结果为后续“枸杞-桑椹-覆盆子汤”复杂发病机制研究提供了一定的基础。

3 结论

本文通过“枸杞-桑椹-覆盆子汤”活性成分收集、PPI网络构建与核心靶点筛选，发现“枸杞-桑椹-覆盆子汤”可通过β-谷甾醇、大豆黄素、桑色素、槲皮素、β-胡萝卜素和鞣花酸等活性成分作用于IL6、IL1B、PPARG、MMP9和VEGFA等核心靶点。分子对接结果表明，全部活性靶点与关键化学成分之间的结合能小于-5 kcal/mol，表明靶点与成分之间可自发形成具有相当结合力且可发挥生物学功能的复合物。GO 与KEGG 分析发现，“枸杞-桑椹-覆盆子汤”对防治糖尿病肾病主要通过癌症途径、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化等通路发挥对糖尿病肾病的治疗作用。体外抗氧化试验结果表明，“枸杞-桑椹-覆盆子汤”具有较强的抗氧化能力，说明抑制抗氧化应激通路也可能是预防糖尿病肾病的潜在路径之一。

综上所述，基于网络药理学对“枸杞-桑椹-覆盆子汤”中活性成分、靶点、通路和体外抗氧化分析发现，具备“多成分、多靶点和多通路”特点的“枸杞-桑椹-覆盆子汤”具有治疗和预防糖尿病肾病的潜力，但后续仍需进一步结合体内和体外试验对其作用机理进行分子层面的探讨。本研究可为“枸杞-桑椹-覆盆子汤”防治糖尿病肾病作用机理与功能性应用提供一定的理论依据。