高负载Cu单原子纳米酶的制备和类酶活性研究*

陈心珠 刘晓宇 张少芳** 穆晓宇** 张晓东1，**

（1）天津大学医学工程与转化医学研究院，天津 300072；2）天津大学理学院，天津 300350）

人工酶是一种具有类似天然酶特性的材料，可以模拟催化人体内的生物化学反应［1-5］。其中，作为新一代人工酶——纳米酶，其相比于天然酶具有更强的稳定性、更低的制备成本以及更加普适的催化反应条件［6-8］，因而被广泛应用于生物医学、检测传感、环境治理以及能源再生等多个领域［9-15］。然而，目前大多数纳米酶的催化活性低、底物选择性差，难以实现催化活性的选择性调控。并且其结构组成复杂，导致催化活性位点不明确、催化机理研究困难［16-17］。因此，纳米酶的设计开发需要新的方向和策略。

近年来，在原子水平构建人工酶的策略为纳米酶的发展提供了新的思路，通过将纳米酶的活性位点精确到具有明确配位结构的几个或几十个原子，然后在原子水平调控设计出具有更高类酶活性和更强选择性的纳米酶［18-23］。比如Liu 等［24］制备了一种由25 个金原子组成的团簇酶（Au25MPA18），通过原子水平的调控，成功地获得了类过氧化氢酶（CAT）活性提升的Au24Cu1MPA18和类超氧化物歧化酶（SOD）活性提升的Au24Cd1MPA18，区别于团簇酶原有的优异的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性。团簇酶自身精确的原子配位结构也为研究人员分析计算催化反应路径以及反应的可能性提供了便利条件。此外，一种新型的人工纳米酶——单原子纳米酶（single-atom nanozyme，SAN）因具有与天然酶相似的催化反应活性中心，且配位环境简单、催化活性高、类酶活性丰富以及回收利用方便，一经提出就成为了研究的热点［25-27］。目前通过“自下而上”以及“自上而下”等方法制备的多种SAN 已经被广泛研究并应用于检测传感以及抗肿瘤、杀菌抗炎、创伤性脑损伤的治疗等生物医学领域［28-32］。

随着SAN 的蓬勃发展，多种金属元素组成的M-N-C 结构（M 为Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Mn、Ru、Ir、Pd 等）被用于模拟天然酶的活性中心位点。其中Cu 元素作为多种天然酶（如漆酶、SOD等）活性中心的组成部分，其价格低廉，获取渠道广泛，被用于制备Cu SAN，在多个领域取得了显著的成果。如Cheng 等［33］将制备的基于多孔碳基质的Cu-N4单原子催化剂应用于电催化CO2还原生成CO， 在-0.9 Vvs.RHE （reversible hydrogen electrode，可逆氢电极）时的CO 法拉第效率（实际生成物与理论生成物的百分比）高达98%，对于CO2还原表现出强的活性和选择性。Zong 等［34］制备的Cu 单原子催化剂同时具有优异的氧还原反应（ORR）和析氧反应（OER）两种电催化活性，被成功应用于锌-空气电极的空气阴极材料，性能优异。Zhang等［35］则将Cu单原子催化剂用于催化苯氧化生成苯酚，展现出83.7%的苯转化率和98.1%的苯酚选择性。以上研究结果均表明了Cu SAN在能源再生以及环境保护中潜在的应用价值。Wu等［36］则将其制备的具有优异类过氧化物酶（POD）活性的高负载Cu 单原子纳米酶（highloading Cu SAN）（~5.1%（质量百分比））与天然乙酰胆碱酯酶以及胆碱氧化酶相结合构建了级联反应系统，对于乙酰胆碱的检测限达到1.24 μmol/L，对于有机磷农药的检测限达到了0.6 ng/L。除了体外研究应用，研究人员也尝试将Cu SAN转化应用于生物医学领域，Wang 等［23］制备了Cu SAN，具有强类POD活性、谷胱甘肽消耗作用和光热性能，协同应用于抗菌可以达到接近100%的效率。Zhang 等［25］则创造性地将具有优异类SOD 活性的Cu SAN 以及其他一系列SAN 与可吸收缝合线结合，应用于创伤性脑损伤后的伤口缝合，结果显示其可以促进血管内皮生长因子的产生，加速脑损伤后的头皮伤口愈合。总之，以单原子作为活性中心的催化剂因其超高的催化性能和选择性已经在越来越广阔的领域展现出良好的应用前景。

虽然SAN 的原子利用率较高，但是较低的原子负载量使得SAN的整体活性仍然有限。据报道，大多数SAN的金属原子负载量低于3%（质量百分比）。随着金属粒子尺度缩小至原子水平，其表面自由能会急剧增加，导致金属原子聚集形成纳米颗粒、金属氧化物晶体等从而影响原子利用率［16，37］。因此，开发具有高分散性和高负载量的SAN 成为目前研究的难点。现有的高负载SAN 在制备过程中多借助金属和载体原子之间强的金属-载体相互作用来实现原子负载量的提升［5，38］，例如Zheng等［39］在制备过程中使用二维层状过渡金属硫族化合物作为载体，借助表面刻蚀后载体上形成高密度的阴离子空位捕获硫脲-过渡金属原子复合物，使Fe 单原子催化剂的负载量达10%（质量百分比）。Li 等［40］使用区别于传统金属有机框架（metal organic frameworks，MOFs）烧结制备单原子的方法，以Cu MOF 作为前驱体，与双氰胺混合后烧结制备Cu单原子催化剂，负载量达20.9%（质量百分比）。其中，双氰胺为单原子锚定提供的丰富的N元素是负载量提升的关键。Wang等［41］以具有高比表面积的硫掺杂介孔碳为载体，借助金属和S原子之间的强键合作用使得制备的Pt 单原子催化剂的负载量达10%（质量百分比）。上述这些研究为制备高负载SAN提供了可行性策略。

本文采用原位锚定策略将金属盐前驱体锚定在氨基化石墨烯量子点形成的框架中，石墨烯量子点以及尿素中富含的N原子促进了金属原子与载体之间形成强的金属-载体相互作用，协同实现了Cu原子的高密度均匀分散。文中系统地研究了金属负载量对于单原子结构和活性的影响，将本研究制备的高负载Cu SAN 与传统的MOFs 锚定法制备的低负载Cu单原子纳米酶（low-loading Cu SAN）的多种类酶活性进行定量对比。结果表明，本研究制备的高负载Cu SAN 具有更高的模拟POD 和SOD 的生物催化活性，并表现出催化选择性，为高负载SAN的制备及类酶活性研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

无水氯化铜（CuCl2，98%）购自北京伊诺凯科技有限公司，尿素（CH4N2O）购自天津希恩思生化科技有限公司，六水合硝酸锌（Zn（NO3）2·6H2O，99%）、过氧化氢（H2O2，30%（质量百分比））、二甲基亚砜（DMSO，＞99.8%）、异丙醇（99.8%）购自上海阿拉丁试剂有限公司，2-甲基咪唑（99%）、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB，99%）购自上海迈瑞尔化学技术有限公司，辣根过氧化物酶（HRP，＞300 U/mg）购自上海麦克林生化有限公司，去离子水（＞99.5%）购自天津元立化工有限公司，醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）、TMB底物显色试剂盒（ELISA，HRP发光）购自北京雷根生物技术有限公司，总SOD 活性检测试剂盒（氮蓝四唑，NBT 法）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 高负载Cu SAN的制备

本文制备的高负载Cu SAN是在参考文献的基础上进一步优化后合成的［42］。将30 ml浓度为1 g/L的氨基化石墨烯量子点溶液与浓度为5 g/L的CuCl2溶液（分别含有0.01、0.02、0.03 或0.05 mmol CuCl2）均匀混合，混合后的溶液在冰水浴中超声15 min，然后立刻在液氮中冻结并放入冷冻干燥机（BSA224S，美国Gibco 生物科技公司）中冷冻干燥。获得的粉末与尿素按照1∶10的质量比研磨混匀放入刚玉舟中。然后将刚玉舟移入真空管式炉（SK-GO6123K，天津中环），在氩气保护下以10℃/min 的升温速度加热至50℃并煅烧2 h。待降温结束后，得到的粉末即为不同掺杂比的Cu SAN。

文中用于对比的低负载Cu SAN也是参考文献的制备方法进一步优化后合成的［25］。首先，将0.590 9 g 2-甲基咪唑和0.508 5 g Zn（NO3）2·6H2O分别溶解在45 ml 和50 ml 甲醇中，然后在磁力搅拌的作用下混匀，60℃静置24 h后收集白色沉淀物，使用无水乙醇洗涤至沉淀呈透明。真空干燥后收集晶体研磨均匀，在氮气保护下900℃烧结2 h。称取120 mg 烧结后的粉末分散于异丙醇中，加入4.5 mg CuCl2，混合液超声震荡。将超声后的溶液离心、洗涤及干燥后，氮气保护下500℃烧结1 h。收集获得的粉末即为低负载Cu SAN。

1.3 高负载Cu单原子纳米酶的表征

使用球差校正透射电子显微镜（AC-STEM，JEM-ARM200F，日本电子）对制备的高负载SAN的原子信息进行观察；在X 射线衍射仪（XRD，Smartlab，日本理学）10°~60°的范围内对制备的SAN 进行了物象鉴定；利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，7900ICP-MS，英国安捷伦）测试了高/低负载的Cu SAN的原子负载量；X射线光电子能谱仪（XPS，Axis Supra，Kratos）测试分析了SAN 的元素组成，并通过分峰拟合推测了原子的成键情况。

1.4 类POD活性检测

本文按照TMB 底物显色试剂盒中的说明书进行操作测试了纳米酶的类POD 活性。首先，将试剂盒中的TMB 显色液、TMB 缓冲液和TMB 氧化剂按照5 000∶5 000∶4 的体积比配制成工作液。然后将20 μl 浓度为100 mg/L 的不同掺杂比例的Cu SAN 和180 μl 工作液混合作为实验组，20 μl 去离子水和180 μl工作液混合作为对照组，将样品放入96 孔板中，使用多功能酶标仪（SuPerMax 3000FA，上海闪谱）实时检测652 nm 处的吸光度值。不同浓度（100、80、60、40、20 和10 mg/L）的高/低负载Cu单原子的类POD活性测试方法与上述操作相同。实验中选取不同浓度的HRP 作为标准品制定了标准曲线，将SAN 在652 nm 处的吸光度代入标准曲线中，对纳米酶的类POD 活性进行了定量。

使用紫外-可见光分光光度计（UV-3600，日本岛津）的动力学模式测试了Cu SAN类POD活性的动力学过程。测试时，将高/低负载SAN、不同浓度的H2O2（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 mmol/L）或TMB（0、6、10、25、50、100、200、400、800 μmol/L）加入醋酸-醋酸钠缓冲液中，保持溶液总体积为200 μl，监测混合后的反应液在652 nm 处的吸光度值。之后对测试的数据进行处理，利用Origin软件作出双倒数图并拟合得到纳米酶催化底物的米氏常数（Km） 和最大反应速率（Vm）。TMB 的摩尔消光系数为：ε652nm=39 000 L·mol-1·cm-1。

1.5 类SOD活性检测

本文中所有类SOD 活性检测均按照总SOD 活性检测试剂盒的说明书进行。首先将试剂盒中的SOD 提取液、NBT 显色液和酶溶液按照100∶30∶30 的比例混合配制成SOD 检测工作液。检测时，分别在96 孔板的孔中加入160 μl 工作液，20 μl 浓度为300 mg/L 的样品，20 μl 反应启动液，光照对照组用20 μl SOD提取液替代样品，将96孔板在日光灯下照射10 min 至光照对照组的溶液变为蓝绿色。然后加入避光对照组，避光对照组用40 μl SOD 提取液替代样品和反应启动液，在560 nm 处检测各孔的吸光度值。其中光照对照组未加入SAN，所以光照之后的反应液在560 nm 处具有明显的吸收；避光对照组未加入SAN且未经过光照，所以在560 nm 处没有明显的紫外吸收。用紫外分光光度计测试上述反应后的混合液在400~800 nm处的吸收曲线以进一步比较高/低负载的Cu SAN的类SOD 活性，取光照对照组作为对照线（Con）。不 同 浓 度（500、400、300、200、100、50 和30 mg/L）的高/低负载Cu SAN 活性测试方法与上述操作相同。按照试剂盒中的说明将吸光度转化为抑 制 率， 公 式 为 抑 制 率/% =（A光照-A实验组）/（A光照-A避光）×100。计算SOD 活力的公式为：酶活力/U=抑制率/（1-抑制率）。

1.6 类OXD活性检测

本文使用TMB 显色法检测样品的类氧化物酶（OXD）活性。实验时，称取TMB 粉末溶解在DMSO中配成浓度为16 mmol/L的工作液，分别将170 μl醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）、10 μl TMB工作液和20 μl 浓度为300 mg/L 的不同掺杂比例的样品加入96孔板中，对照组使用20 μl醋酸-醋酸钠缓冲液替代样品。将各组溶液混合均匀后，使用多功能酶标仪实时检测96 孔板中的液体在652 nm 处的吸光度值。不同浓度的高/低负载Cu单原子活性测试方法与上述操作相同，使用的样品浓度分别为500、400、300、200、100和50 mg/L。

1.7 类CAT活性检测

本文借助紫外-可见光分光光度计检测H2O2在240 nm 处的吸光度的变化来比较样品催化H2O2分解的能力。使用去离子水将30%（质量百分比）的H2O2稀释为40 mmol/L，取180 μl 放入比色皿中，然后加入20 μl Cu SAN（浓度为500 mg/L）混合均匀，立刻在紫外-可见光分光光度计的动力学模式下检测加入样品后5 min 内溶液的吸光度值变化。另外取180 μl 稀释的H2O2溶液（30 mmol/L）与20 μl 浓度为500 mg/L 的样品混合孵育，每20 min取反应液放入比色皿中测定吸光度值。另一方面，使用溶氧仪（LD101 探头，HACH HQ40d，US）测试纳米酶催化H2O2分解生成O2的量来更加直观地比较高/低负载Cu SAN 的类CAT 活性。测试时，首先向盛有6 ml 去离子水的小烧杯中鼓入N2以排出溶液中的O2，待水溶液中O2的含量低至0.6 mg/L时，迅速向溶液中依次边搅拌边加入60 μl H2O2（10 mol/L）和90 μl 纳米酶（浓度为2 g/L），对照组用90 μl 去离子水代替纳米酶。使用溶氧仪每10 s记录一次液体中O2的含量。同时为了更加直观的观察以及证明样品的类CAT活性，实验中取3个离心管均放入500 μl 浓度为2 mol/L 的H2O2，实验组的两个离心管中分别加入20 μl 高/低负载Cu SAN（浓度为1 g/L），对照组用20 μl 去离子水代替SAN，将离心管静置10 min，观察气泡产生的速度和密度并拍照记录。定义过氧化氢酶的酶活力单位（unit）为在25℃、pH 为7.0 条件下，在1 min 内催化分解1 μmol H2O2即为1 个酶活力单位（1 U）。计算SAN类CAT活力值的公式为：CAT活力值/（U·μg-1）=消耗H2O2的微摩尔数/（反应分钟数×样品质量）。H2O2的摩尔消光系数为：ε240nm=39.4 L·mol-1·cm-1。

2 结果与讨论

2.1 高负载Cu SAN的表征分析

利用原子分辨的AC-STEM 观察金属掺杂比为0.03 mmol 时制备的高负载Cu SAN 中Cu 单原子的分布，如图1a 中蓝色圆圈所标记，有许多单个亮点均匀分布，因为Cu原子的相对分子质量高于C、N 和O 等，所以可以认为图中亮点为Cu 原子以单原子的形式分散在石墨烯基底材料上，并且原子分布密度高。通过XRD 谱表征了不同掺杂比下Cu SAN 的衍射峰（图1b），在金属掺杂量为0.02和0.03 mmol 时，图谱中只显示了石墨烯载体在25°和44°附近的特征峰，分别归属于石墨碳的（002） 晶面和（010） 晶面。当掺杂量增加到0.05 mmol时，图谱中开始有Cu纳米颗粒尖锐的晶体衍射峰出现［43］。通过ICP-MS 检测了高/低负载Cu SAN 中Cu 元素的含量，结果表明0.03 mmol 掺杂时制备的高负载Cu SAN 中Cu 原子负载量为7.66%（质量百分比），是低负载Cu SAN 的12 倍（图1c）。利用XPS技术表征高负载Cu SAN的元素组成和结构。图1d~f展示了高负载Cu SAN的XPS图谱，全谱的元素分析结果显示Cu SAN中含有C、N、O 和Cu 元素。对N1s高分辨能谱图进行分峰拟合，发现材料中的氮主要由吡啶氮（398.5 eV）、吡咯氮（399.6 eV）和石墨烯氮（400.5 eV）组成［44］。而C1s的高分辨图显示C 主要以C=C 双键（284.8 eV）、C―N 键（286.3 eV）和O―C=O 键（288.6 eV）的形式存在［45-46］。

Fig.1 Structural characterizations of Cu SAN

2.2 类POD活性评估

基于以上结构表征，本文对高/低负载Cu SAN进行系统地催化性能评估。首先，以TMB 为显色底物，检测了Cu SAN 的类POD 活性。TMB 在H2O2参与下可由POD 催化生成蓝色的oxTMB 产物，此产物在652 nm处有特征吸收峰（图2a）。图2b显示，随着金属前驱体掺杂量由0.01 mmol提升为0.05 mmol，Cu SAN 的类酶活性呈现先升高后降低的趋势。当掺杂量为0.03 mmol 时溶液反应60 min 吸光度值达到2.35（图2c）。结合XRD结果，在掺杂量为0.05 mmol时制备的SAN 可能会形成金属纳米颗粒，因此继续提高金属前驱体的添加量不但没有提高类POD 催化活性，反而因为降低了原子利用率，使得SAN的整体活性呈现下降的趋势。实验进一步对比研究了高（掺杂量为0.03 mmol）/低负载Cu SAN 的类POD 活性的差异，如图2d，e所示，在相同的质量浓度和测试条件下，本文制备的高负载Cu SAN的催化活性和催化反应速率相比于低负载SAN 显著提升。根据天然HRP 的活性作标准曲线对SAN 的活性进行了定量分析，结果表明，高/低负载Cu SAN 的类POD 活性分别约为0.134 U/mg和0.039 U/mg，高负载Cu SAN相比低负载SAN 提升了约3.4 倍（图2f）。此外，本文进一步研究了高/低负载Cu SAN 类POD 活性的动力学过程，通过分别测试不同H2O2或TMB浓度下SAN催化TMB生成蓝色oxTMB产物的初始速度，通过拟合可以得到SAN对于两种底物的Km及Vm。结果显示高负载SAN 对于TMB 和H2O2的Km分别为0.211 mmol/L和18 mmol/L（图S1），低于现有研究中多数纳米酶［25-26，32，36，47-49］（具体参数比较见表S1），表明其对于底物具有良好的亲和力。纳米酶优异的类POD 活性可以使检测传感更加灵敏，如Wu 等［36］借助模板制备了一种高负载的Cu SAN（Cu-N-C），具有优异的类POD 活性，作者将其研究应用于乙酰胆碱和有机磷农药的检测，取得了显著的成效。文中终浓度为10 mg/L 的Cu-N-C 催化TMB显色反应，吸光度为0.9，比本研究中所能到达的吸光度低。Yan等［14］制备的一种Pt/CeO2SAN在终浓度为10 mg/L时催化TMB显色反应6 h吸光度达到1.6，而本研究中的高负载Cu单原子在相同浓度下仅1 h 时吸光度可达2.4，远高于Pt/CeO2。表明本文制备的SAN 类POD 活性优异，具有应用于检测传感的潜力。

Fig.2 POD-like activity of Cu SAN

2.3 类SOD活性评估

SOD 是人体内重要的抗氧化酶，可以将体内病理状态下产生的过量的超氧阴离子（O2·-）催化生成O2和H2O2，从而避免O2·-被催化生成次级自由基（ONOO-）对人体产生进一步的伤害［50］。本文使用NBT 显色法检测了Cu SAN 的类SOD 活性。NBT作为显色底物，在光照和O2·-存在的条件下被还原成蓝绿色的甲臜，而SOD 可以抑制甲臜的产生（图3a）。基于该反应原理，本文研究了不同掺杂量对Cu SAN的类SOD活性的影响，实验结果表明，随着金属前驱体投料量的提升，SAN 类SOD活性逐渐增强，当掺杂浓度为0.03 mmol时，抑制率高达87.4%（图3b）。图3c为反应后溶液的紫外-可见光分光光度计吸收谱，可以看出高负载的Cu SAN在560 nm处的吸光度明显低于光照对照组（Con），并且低于低负载Cu SAN，表明高负载Cu SAN 具有更优的类SOD 活性，可以有效清除O2·-。当反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD 酶活力单位定义为一个酶活力单位（unit，U）。图3d对高/低负载Cu SAN的类SOD活性进行定量分析，结果表明高负载Cu SAN的类酶活性可以达到2.18 U/μg，而低负载Cu SAN的活性约为0.24 U/μg，高负载Cu SAN的酶活力值约是低负载Cu单原子的8.88倍。此外，研究了高/低负载的Cu SAN浓度依赖的类SOD活性，结果显示浓度为20 mg/L 时高负载Cu SAN 即显示出78.6%的抑制率，而低负载Cu SAN 在浓度高达50 mg/L 时抑制率只达到了72.7%（图3f）。该研究结果揭示了通过增加SAN中Cu原子的负载量可实现其类SOD活性的增强。相同的浓度水平下，本研究制备的高负载Cu SAN的类SOD活性高于现有研究中多数纳米酶（图3e）。如Ruan 等［51］制备的Pd/CeO2纳米酶在浓度为80 mg/L时SOD抑制率仅为67%，远远低于本文中的高负载Cu SAN。Huang等［52］制备的V2O5纳米线在浓度为15 mg/L时约为70%，与本文达到了相似的水平。

Fig.3 SOD-like activity of Cu SAN

2.4 类OXD活性评估

OXD 以O2作为电子受体催化底物氧化生成H2O 或H2O2。本文以TMB 作为显色底物，检测了制备的Cu SAN 的类OXD 活性（图4a）。根据图4b，c 所示，当掺杂比为0.03 mmol 时，高负载Cu SAN 的催化活性达到最高，反应180 min 后oxTMB在652 nm处吸光度值可以达到0.31。但是，将高/低负载的Cu SAN在相同的质量浓度下进行比较，发现高负载Cu SAN 催化TMB 生成的蓝色产物的吸光度值在60 min 时为0.18，而低负载Cu SAN 催化反应60 min 时吸光度值可达0.95，是高负载的5.28 倍（图4d，f）。进一步计算高/低负载的Cu SAN催化TMB氧化的反应速率，结果显示，当浓度均为50 mg/L 时，低负载Cu SAN 的反应速率为3.03 μmol/（L‧min），而高负载的Cu SAN 的反应速率仅为0.817 μmol/（L‧min），低负载SAN的反应速率是高负载的3.7 倍（图4e）。这个结果体现了高负载Cu SAN的类酶催化选择性，在实际的检测过程中，类OXD 活性会提高反应的基底，对于类POD 活性的应用是一种副反应，因此制备只具有单活性的纳米酶对于检测是有益的。如Liang 等［55］研究制备了一种颜色呈白色的单活性GeO2纳米酶，该纳米酶只具有类POD 活性，避免了类OXD活性的影响。推测本文中高/低负载SAN呈现出不同类酶活性选择的结果可能与材料的结构有关，产生这种现象的原因需要进一步的研究。

2.5 类CAT活性评估

CAT 是以H2O2为底物的一种氧化还原酶，可以催化H2O2分解产生O2和H2O（图5a），从而有效清除体内产生的过量的H2O2。因此本研究也进一步探索了制备的高负载Cu SAN的类CAT活性。将H2O2和SAN均匀混合后，检测H2O2在240 nm处的吸光度值随时间的变化来定量对比高/低负载的Cu SAN对H2O2的分解能力。结果如图5b所示，反应120 min 后高/低负载Cu SAN 的反应液在240 nm处的吸光度分别由1.047 降低至0.614 和0.506，表明低负载Cu SAN具有更强的分解H2O2能力。并且根据动力学测试可以看出，低负载Cu 单原子的催化速率明显较快（图5c）。图5d 对比了Cu SAN 对H2O2的清除率，发现在反应1.5 h后低负载Cu SAN的清除率为57.6%，高负载为44.5%，这个结果也证明了在相同时间内低负载Cu SAN 比高负载Cu SAN可以催化分解更多的H2O2。此外，根据酶活力的定义计算得到高负载Cu SAN的类过氧化氢酶 活 力 值 为43.9 U/μg，而低负载Cu SAN 为60.5 U/μg，表明低负载Cu SAN 的催化活性约是高负载Cu SAN 的1.37 倍（图5e）。研究中进一步借助溶氧仪测定了高/低负载Cu SAN 加入H2O2溶液后催化产生的O2量来比较其活性差异，结果表明，在100 mmol/L 的H2O2中加入SAN 5 min 后，低负载Cu SAN 产生了3.67 μmol 的O2，高负载SAN 仅产生了1.87 μmol（图5f）。通过观察加入SAN 后，H2O2溶液中产生的气泡数量也可以直观地比较高/低负载Cu SAN 的类CAT 活性，如图5f 中插图所示，SAN和H2O2混合10 min后，低负载Cu SAN产生了更多的气泡，说明催化更多的H2O2产生了O2。在一些显色检测的应用中，如Lu 等［56］将制备的Fe-N-C SAN 应用在比色检测H2O2和谷胱甘肽，H2O2作为检测目标，材料的类CAT 活性可能会对这种检测产生干扰。因为具有较强类CAT 活性的纳米酶会在类POD催化过程中出现竞争底物现象，从而使得计算出的底物亲和力和反应速率产生较大的偏差。在实际应用过程中，也会干扰反应路径以及降低检测灵敏性。因此，本文中制备的高负载Cu SAN略差的CAT活性或许有助于其在更广泛领域中的应用。

Fig.5 CAT-like activity of Cu SAN

现代医学研究表明，多种疾病的产生和发展与生物体中过量活性氧（ROS）有关，具有清除ROS 作用的纳米酶被证明可以延缓相关疾病的进程。Wu 等［57］制备了一种具有类POD、SOD、CAT、抗坏血酸过氧化物酶（APOD）以及硫醇过氧化物（TPx）等多种类酶活性的RuO2-PVP 纳米酶，将其应用在小鼠帕金森病模型中可以有效地提高酪氨酸羟化酶的表达以及抑制小胶质细胞被激活从而减轻炎症并防止神经细胞变性。Moglianetti等［58］制备了具有类POD、CAT、SOD活性的Pt纳米酶，体外研究表明，该纳米酶可以有效降低人脑海绵状畸形疾病模型中病理细胞内ROS 的总体水平。Yan等［14］将制备的具有类POD、SOD、CAT、GPx等活性的Pt/CeO2应用于创伤性脑损伤的治疗，能够有效减轻伤口处的炎症水平，改善受损的神经认知能力。以上研究均表明，具有多种类酶活性的纳米酶在氧化应激相关疾病的治疗中可以有效发挥作用。本研究中SAN具有优异的类POD和SOD活性选择性，并且具有一定的类CAT 活性和较弱的类OXD 活性，总体上可以降低体系中的H2O2和O2·-等ROS。综上所述，本研究制备的Cu SAN 可能会通过清除生物体内病理状态下产生的过量ROS，从而调节生物体的稳态平衡，有望应用于糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病、炎症等一系列氧化应激相关疾病的治疗。

3 结 论

本研究通过原位锚定策略制备了一种高负载Cu SAN，碳基载体中富含的N 原子使得更多的金属Cu 原子被牢固锚定，Cu 原子负载量达到7.66%（质量百分比）。实验系统性评估了高/低负载Cu SAN 的多种类酶活性（类POD、类SOD、类OXD、类CAT）的差异。以TMB和NBT为显色底物，活性定量结果表明，高负载Cu SAN具有优异的类POD 和SOD 活性，分别是低负载Cu SAN 的3.4 倍和8.88 倍。动力学研究结果表明，本文制备的高负载Cu SAN 对底物TMB 和H2O2的Km分别为0.211 mmol/L 和18 mmol/L，低于现有研究中多数纳米酶。此外，高负载Cu SAN表现出对类POD和SOD 活性的催化选择性。综上，本文研究结果为制备高负载SAN 提供了思路，系统的活性研究增强了SAN实际应用转化的可能性和可信度。

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