m6A甲基转移酶家族Fiona/METT-10/METTL16的功能

龚 娟 黄武强 容益康

（1）南华大学衡阳医学院药学院，衡阳 421001；2）南华大学衡阳医学院附属第二医院，衡阳 421001；3）南华大学衡阳医学院基础医学院，衡阳 421001）

化学修饰是调控生命活动的重要手段，广泛见于DNA、RNA和蛋白质中，其中RNA上的化学修饰最为丰富，迄今为止人们已经发现了上百种不同类型的RNA 修饰，包括脱氨基、异构化、糖基化和甲基化等［1］。其中甲基化修饰几乎占据2/3［2］，尤其是腺苷上第6 位氮原子的甲基化修饰N6-甲基腺苷化（N6-methyladenosine，m6A）是目前数量最多且研究最充分的修饰之一，它几乎存在于所有类型的RNA 中。1970 年就已经发现m6A 是mRNA 上最丰富的内部修饰，而且几乎每个mRNA 中都有2~3 个m6A 修饰位点［3］，主要靠近终止密码子和3'非翻译区（UTR）区域［4］。

转录后的m6A 修饰能从多方面调控RNA 的功能，它对RNA 的二级结构会产生不同的影响，在双链中会降低其稳定性，而未配对腺嘌呤上的m6A修饰会增加临近螺旋的稳定性［5］。m6A 会被某些m6A 识 别 蛋白识别，在pre-mRNA 的 剪 接［6］、降解［7］和翻译［8］等过程中起关键作用。此外，m6A的修饰是一个动态过程，它可以被m6A去甲基转移酶如FTO［9］和ALKBH5［10］去除，调控RNA 代谢的这种动态变化会影响哺乳动物的昼夜节律［11］、干细胞发育分化［12］以及肿瘤的发生［13］等。

METTL3/METTL14 是最早被鉴定出来的m6A甲基转移酶复合物，它们负责真核生物mRNA 中大部分的m6A修饰［14-15］。METTL3在该复合物中起着核心作用，它能利用S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）甲基化腺苷酸［16］，而METTL14 主要是在维持复合物稳定性和识别RNA 底物方面起作用［17］。一系列研究表明，WTAP、RBM15/15B 和KIAA1429 等 蛋 白 质 和METTL3/14 复合物一起发挥作用［18］，而且这些蛋白质的缺失都会造成m6A水平的降低［19］。

近年来发现的另外一种甲基转移酶METTL16，是一种从低等生物到高等生物均高度保守的蛋白质［20］，METTL16 和METTL3/14 复合物虽然都是m6A甲基转移酶，但它们之间的结构以及识别底物的特异性有较大的差异。与METTL3/14 复合物相比，METTL16 蛋白可以独立发挥其甲基化功能。METTL3/14倾向于甲基化单链RNA，而METTL16更倾向于识别共识序列附近包含双链的RNA 底物［21-22］。作为SAM依赖的甲基转移酶METTL16和METTL3/14复合物都属于I类甲基转移酶，并带有保守的由β折叠和α 螺旋组成的罗斯曼折叠，它们之间的整体三维空间结构类似，但其β折叠明显不同，这可能就是它们之间底物序列偏好性不同的原因［23］。

目前已知METTL16 是SAM 合成酶MAT2A（methionine adenosyltransferase 2）的pre-mRNA 和小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6 的甲基转移酶［22，24］，也发现METTL16可以特异性识别肺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）lncRNA 的三螺旋结构［25］，但其甲基化作用并未被证实，猜测METTL16 除了甲基转移酶活性外可能还有别的作用，最新研究发现METTL16 以不依赖其甲基酶活性的方式促进翻译也说明了这一点［26］。本综述除了主要讨论m6A 甲基转移酶——METTL16，还简单介绍了其他的m6A甲基转移酶（表1）。

Table 1 m6A Methyltransferases表1 m6A甲基转移酶

1 METTL16及其同源蛋白的结构

METTL16 是一个保守蛋白质，在哺乳动物中有562 个氨基酸，可以分为N 端RNA 结合域（RBD）、甲基转移酶结构域和脊椎动物保守区（VCR）（图1）［24］，而在大肠杆菌、线虫和果蝇等低等生物中只有N 端的两个结构域，没有VCR 区域［20］。不同于METTL3/14 复合物的异源二聚体，全长的METTL16是以同源二聚体形式存在［33］，而且METTL16在没有VCR域的情况下是单体，并且其甲基化活性也不会消除。

1.1 甲基转移酶结构域

METTL16 蛋白N 端残基1~291 一直以来都被认为是甲基转移酶结构域， 直到2018 年Ruszkowska 等［23］才发现它是由残基40~291 组成。该结构域高度保守（图2），其结构中有一个由正电荷簇形成的宽沟槽［24］，该沟槽主要是与RNA中带负电的磷酸主链相互作用。SAM 的腺苷部分由Thr164 残基识别，结合在甲基转移酶结构域的疏水袋中，通过氢键与其残基相互作用［24］。METTL16中残基184~187 NPPF是活性位点，在所有生物体中都保守，位于SAM 结合位点和正电荷沟槽之间，将这些残基进行突变（如PP185/186AA和F187G）则会破坏METTL16 的甲基化活性［22］。METTL16中的Arg200是组成构象的关键残基，它能和RNA 直接接触，在大肠癌患者中该氨基酸突变为谷氨酰胺，Doxtader 等［33］发现，R200Q 突变会显著提高其甲基化活性，但不影响其与RNA 的亲和力。在这段区域中还包含一段由190~218残基组成的无序环，将其删除会破坏其甲基化活性，而突变3 个氨基酸（即RRR-200-203-204-EEE）就可以恢复其甲基化作用［22］。

METTL16 的甲基转移酶结构域中一个比较特别的方面是残基163~167 会形成一个有序多肽环（K-Loop），METTL16 可以通过K-Loop 阻断SAM进入疏水袋从而降低甲基化效率。当没有结合RNA 时Lys163 暴露在外，其他的疏水侧链如Met167也远离SAM结合位点，而结合RNA后会通过疏水作用将K-Loop 靶向至甲基转移酶结构域，导致Lys163的侧链占据SAM催化袋从而封闭SAM结合位，所以在不同SAM浓度下METTL16会通过调节K-Loop 构象从而调节其甲基化效率。用丙氨酸取代K-Loop的氨基酸会显著增加其甲基化活性，即使在较低浓度的SAM 条件下也能表现较高的甲基化水平，而对RNA的亲和力影响微乎其微［33］。

1.2 N端RNA结合域

Mendel 等［22］把N 端前40 个残基归为RNA 结合域，因为他们发现敲除METTL16前40个残基后无法与RNA相互作用从而进行甲基化。METTL16的N端结构域中存在几个高度保守的极性正电荷残基，这些残基形成了一个足以容纳双链RNA 的沟槽，该沟槽可以和RNA 带负电的磷酸主链相互作用。即使甲基转移酶结构域中也包含一个正电荷沟槽，沟槽内排列着能够吸引带负电荷RNA 的氨基酸，但它本身并不足以将RNA 保留在沟槽内，所以N端的RNA结合域对于METTL16的甲基化作用至关重要，将该结构域的带电残基突变会影响与RNA的结合，进而破坏对RNA的甲基化［22-23］。

1.3 高等生物特有的VCR结构域

VCR 结构域是高等生物中特有的一段区域，位于人METTL16 蛋白C 端的310~562 残基，该区域包括VCR1（残基310~400）、VCR2（残基514~562）以及两者连接区域（残基401~513）。由于VCR 之间跨越了残基514~562 这一段长的无序区域，所以直到2020 年才通过去除两个VCR 之间的连接区域确定了该区域的晶体结构［21］。Aoyama等［21］发现，METTL16的N端残基1~291的蛋白质就具有甲基化活性，而C 端VCR 结构域能够进一步提高N端片段对底物的亲和力从而增强甲基化效率。METTL16 富含精氨酸的“RRR”区域（残基382~388）缺失会影响METTL16 与RNA 的结合活性从而使其甲基化活性降低，VCR 在拓扑结构上与U6特异性末端尿苷酰转移酶（TUT1）的激酶相关1（KA1）结构域同源，它主要是通过与RNA结合发挥作用［34-35］。Aoyama 等［21］在体外纯化了N端结构域和KA1 的重组蛋白，发现这个蛋白质的甲基化效率比单独的N 端蛋白质高，而且突变KA1 的RNA 结合位点明显降低了其甲基化效率，所以他们认为在METTL16中VCR域作为一个钳子结合双链RNA。虽然这些结构域在结构上有高度同源性，但是在序列上并没有很高的相似性［36］。目前关于METTL16 的VCR 靶向RNA 的序列特异性并不清楚。

2 METTL16的甲基化功能

目前为止已经证实了METTL16 的底物，包括哺乳动物MAT2A、线虫sams 的pre-mRNA、U6 snRNA 以及拟南芥中若干mRNA，其中SAM 合成酶的pre-mRNA 和U6 底物中都包含保守的UACAGAGAA 序列（下划线处是甲基化位点），但是在人类中具有这个序列的mRNA 大部分都没有被甲基化［20］。为了寻找底物特征，研究者们针对U6 和MAT2A pre-mRNA 构建了一系列的突变，发现它们都需要这9个保守碱基和茎环结构才能被甲基化［22，33］，但最新的研究却发现，在拟南芥中METTL16 同源蛋白FIONA1 的甲基化作用既不需要这9 个保守碱基也不需要二级结构［30］，目前发现的METTL16 的靶点还十分有限，其底物共性尚不明确。

2.1 U6 snRNA

U6 是一个非编码的snRNA，它与其他snRNA和蛋白质组装成一个剪接体复合物参与pre-mRNA的剪接过程。大约40年前就发现U6的A43处有一个m6A 修饰，并位于发夹结构的茎突处［37］，在酵母中突变该位点会导致死亡［38］。直到2017 年才证明了METTL16 是其甲基转移酶［24］，Warda 等［39］认为METTL16 很有可能是在U6 与其他部分结合之前发挥其甲基化作用。

除了酿酒酵母的U6 上没有该修饰外，裂殖酵母以及更高级的生物中均有该修饰，尽管U6 中m6A 附近区域对于指导剪接是很有必要的，但其m6A 修饰的具体作用仍然不明确［40］。Warda 等［39］发现，在细胞中敲低METTL16 并不会影响U6 的整体表达水平，而U6 上的m6A 水平明显降低了。在小鼠、细胞和拟南芥中发现敲除METTL16 后并没有发现明显的整体剪接变化，但最近在裂殖酵母中发现U6 上的m6A 修饰对5'端剪接位点为非“AAG”且第4 位内含子为“A”碱基的剪接有促进作用［40］。这是目前唯一关于U6上m6A修饰作用的研究，而在其他生物中的作用目前尚不可知。

2.2 MAT2A pre-mRNA 3'UTR

SAM 作为细胞内一种重要代谢物，是DNA、RNA 和蛋白质大多数甲基化反应的甲基供体，对基因的正常调控至关重要。细胞内SAM 的水平受到严格调控，这与细胞增殖、免疫和衰老有关。MAT2A 是催化甲硫氨酸和三磷酸腺苷（ATP）生成SAM的关键酶［41］。2017年的研究发现在细胞中METTL16 通过负反馈机制调节MAT2A pre-mRNA的剪接以调控细胞内的SAM稳态［24］（图3）。而且敲除METTL16的小鼠能发育到囊胚时期，但在着床前后会停止发育死亡，转录组测序发现在该小鼠中MAT2A含量显著降低，并且着床前清除了基因的大量甲基化，而着床后要恢复其正常水平，所以作者认为MAT2A 的降低造成了小鼠的死亡［22］。MAT2A 的3'UTR 处包含6 个发夹结构（hp1~6），其序列、结构和位置都很相似［42］，环中都有近乎不变的“UACAGAGAA”序列，这些发夹结构通过不同的机制参与METTL16介导的细胞调控。在体外METTL16 能分别对这6 个发夹结构进行甲基化，但其效率不同，其中hp5 的效率最高［33］。METTL16 能够直接结合hp1，根据细胞内SAM 浓度调控MAT2A 的剪接。当SAM 浓度较高时，METTL16 会结合hp1 并进行甲基化，然后快速解离以保留有内含子的亚型，随后该亚型被YTHDC1 识 别 并 降 解［43］，可 能m6A 修饰 会 降 低METTL16 与RNA 的结合能力从而引发了这一现象。而当SAM浓度较低时，METTL16虽然无法对hp1 进行甲基化，但会增加在pre-mRNA 的滞留时间导致内含子剪接变多，从而表达更多成熟的mRNA 用来 翻 译MAT2A 蛋白。METTL16 酶活 位点突变不影响成熟mRNA 的形成，而RNA 结合位点突变则会对它产生影响，这就说明了METTL16的结合作用对于诱导MAT2A pre-mRNA 的剪接至关重要［24］。蛋白质结构分析叙述了METTL16 的VCR 结构域是通过促进蛋白质与RNA 结合发挥作用，而这段区域只存在脊椎动物中，这可能是METTL16 只在高等动物中才能驱动剪接，而在低等动物中目前还没发现这个作用的原因。

2.3 线虫sams pre-mRNA

线虫METT-10是METTL16的同源蛋白质，都是SAM 合成酶pre-mRNA 的甲基转移酶。但与哺乳动物不同的是，在线虫sams pre-mRNA的内含子2 和外显子3 连接处发现有一个m6A 修饰，并且将METT-10 敲除后就检测不到该修饰了，体外实验也证实了METT-10能对该位点进行甲基化（图3）。与METTL16 甲基化底物中都包含的保守序列UACm6AGAGAA 相 比，sams 的m6A 位 点 附 近UACm6AGAAAC 序列有一个碱基的差别，这个修饰位于剪接位点而且在低等生物中这段区域比较保守。在线虫的剪接过程中，U2 辅助因子35（U2 auxiliary factor 35，U2AF35）需要结合3'端的AG二核苷酸以招募U2AF 复合体从而剪接出成熟的mRNA。当SAM 含量不足时，METT-10 无法对sams的pre-mRNA进行m6A甲基化从而能合成编码蛋白质的mRNA，而SAM 含量较高时，METT-10会对sams pre-mRNA 的3'剪接位点AG 的腺嘌呤上进行m6A甲基化，U2AF35与有m6A修饰位点的亲和力降低从而会影响其正确剪接，进而导致它的降解，以此调控机体内SAM 的稳态［44-45］。目前针对线虫中sams 的降解机制有两种，其中一种机制是U2AF35 虽然无法结合到正确的剪接位点进行剪接，但是它会结合另一个近3'端剪接位点进行剪接产生无意义的mRNA 亚型，从而被降解（图3），另一种则是没有剪接过程而是pre-mRNA直接进行降解，这两种降解机制虽然有些许差异，但其生物学意义一致。其他无脊椎动物的SAM 合成酶是否也符合上述的剪接调控机制需要进一步证实［44］。在拟南芥中METTL16 同源蛋白FIONA1 无论是在低或者高SAM 条件下，都不会对SAM 合成酶的pre-mRNA 进行甲基化，也不会影响它的转录水平［30］。

虽然在哺乳动物和线虫中METTL16 及其同源蛋白质调控SAM 的机制不一样，但调控的生物学功能一样（图3）。在哺乳动物中发现METTL16还有帮助MAT2A pre-mRNA 剪接的功能，所以METTL16的敲除会使机体中的SAM含量减少，研究者们猜测VCR结构域对METTL16的剪接功能至关重要。线虫中并无这一结构域，敲除METT-10远3'端剪接位点缺少甲基化修饰，从而能正确剪接合成成熟的mRNA使SAM含量增多［44］，关于这一现象目前并没有一个合理的解释，猜测可能是因为物种进化导致的。

3 METTL16非酶活功能

METTL16 的甲基转移酶和非酶活功能一直以来备受关注。与MALAT1 lncRNA之间的相互作用很早就发现了，但其是否依赖甲基转移酶活性尚不明确。另外还发现，METTL16 以一种不依赖甲基转移酶功能促进翻译，这都说明METTL16 拥有除了甲基转移酶功能以外的其他作用。

3.1 MALAT1 lncRNA

MALAT1 是一种在哺乳动物中常见的高度保守的核保留lncRNA，2003 年首次发现于非小细胞肺癌中，它在多种肿瘤中高表达，能促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭等。研究发现，MALAT1 3'端形成的三螺旋结构可以保护MALAT1免受3'→5'核酸外切酶的剪切，从而维持MALAT1 的完整性，并使其在细胞中积累［46-47］。体内外实验均证明METTL16 能特异性识别MALAT1 的3'端三螺旋结构［25］，而且MALAT1 与METTL16 同源二聚体相互作用，而不与无VCR结构域的METTL16相互作用。虽然发现MALAT1与METTL16相互作用的位点附近有一个m6A 修饰的腺苷［48］，但它们之间的结合是否涉及甲基化尚不清楚［23］。

3.2 METTL16促进蛋白质翻译

METTL16 在细胞核和细胞质中皆存在，且其定位不依赖甲基转移酶活性，其甲基化修饰作用在细胞核中完成，而在胞质中它可能发挥其他功能。在人细胞中观察发现，敲除METTL16 会显著降低翻译效率，进一步研究也表明METTL16 促进翻译的功能不依赖于其甲基转移酶功能。mRNA的5'端m7G 帽子和真核翻译起始因子3 （eukaryotic translation initiation factor 3 subunit，eIF3）在翻译起始过程中发挥着至关重要的作用，METTL16 以不依赖RNA 的方式与eIF3a/b 和m7G 特异性结合，表明METTL16 可能参与翻译起始。对METTL16的结构进行突变后发现，其甲基转移酶结构域对于与eIF3a/b 和5'帽区的相互作用以及促进翻译起始是必需的，同时研究也发现METTL16 与核糖体RNA 相互作用，且有助于翻译起始复合物的组装并促进4 000多个mRNA转录本的翻译［26］。

4 METTL16其他功能

MAT2A pre-mRNA、U6 snRNA 和MALAT1 lncRNA是目前比较明确的与METTL16有相互作用的RNA，还有其他几种类型的RNA 也认为是METTL16 潜在的相互作用者，其中rRNA 在METTL16 的免疫沉淀中大量富集，但敲除METTL16 并不会导致rRNA 总体表达出现差异，猜测可能是rRNA在细胞中含量太多而导致的非特异结合［39］。在大肠杆菌中发现METTL16的同源基因编码的RlmF 和RlmJ 蛋白对23S rRNA 进行m6A甲基化［49］，然而在脊椎动物中却发现rRNA 上的m6A 修饰是由另外两种甲基转移酶介导的［32，50］，所以目前METTL16 与rRNA 的关系还不明确。MAT2A 是METTL16 在mRNA 中研究较多的一个靶点，在老鼠和拟南芥中也发现METTL16 能甲基化几种mRNA，但其共性和具体功能尚不明确，同时还发现了一些其他潜在的mRNA 结合靶点，包括RBM3、STUB1 和NT5DC2 以及β2M、HIF-1α和MYC等，但需要进一步研究明确［39］。

5 METTL16在癌症中的作用

m6A修饰影响许多生物学过程，越来越多的研究表明与m6A相关的蛋白质在肿瘤的发生发展中起着重要作用，如宫颈癌［51］、前列腺癌［52］、乳腺癌［53］等。METTL3 已成为肝癌预后的潜在生物标志物［54］，并且针对METTL3 开发出了能有效缓解急性髓系白血病的小分子抑制剂［55］。一些报告表明METTL16 也与癌症有关，如在肝癌和乳腺癌中METTL16 异常过表达，而且其表达的增加与不良预后相关［26，56-57］；在大肠癌中存在METTL16 重要残基的突变［58］；在胃癌中METTL16 表达水平升高，并通过增强cyclin D1 mRNA 的稳定性促进胃癌 细 胞 的 增 殖［59］。与METTL16 相 互 作 用 的MALAT1 能特异性识别致癌基因，但目前关于这一方面的作用是未知的，有推测认为这与肿瘤发生相关［25］。

6 结语与展望

综上所述，METTL16 的功能总结如表2，但依然还有很多未知，目前针对它甲基化SAM 合成酶的 pre-mRNA 和U6 snRNA 研究较多，其是否存在其他的底物以及底物特异性和共性是什么，都需要进一步的研究。U6 是剪接复合体的酶活中心，其m6A位点处高度保守，但仅在酵母中发现其影响某一类RNA 的剪接，在其他模式生物中是否也适用这一机制或者有别的具体调控机制还需要探索。METTL16 可能也直接参与MAT2A pre-mRNA 剪接过程，但具体机制尚不明确。最新研究发现，METTL16 缺失显著抑制了人肝癌细胞的生长、迁移和侵袭，而且METTL16 的甲基转移酶结构域对其甲基化依赖和非甲基化活性都至关重要，开发针对该结构域的有效抑制剂在癌症治疗中具有巨大的治疗潜力［26］。