构建掺杂铕（Eu）的二氧化硅（SiO2）纳米粒子载药平台

韩慧敏，杨子熙，王嘉遥，贾媛媛，李忠涛，郝利国*

（1.齐齐哈尔医学院医学技术学院，2.基础医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

胰腺癌死亡率较高、预后较差，治疗手段包括手术、放射治疗（放疗）及化学治疗（化疗）等［1-5］，效果均有限，且难以避免对人体造成损伤。纳米粒子表面具有丰富的官能团，可被靶向基团或其他响应型材料修饰，在提高生物安全性的同时在特定区域聚集［6］。利用纳米粒子载药可增加人体药物利用率、减少药物对正常组织的损伤，改进治疗恶性肿瘤的效果，现已广泛用于药物递送系统（drug delivery system， DDS）。介孔氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）系无机纳米材料，结构为开放式多孔式；通过将药物加载到二氧化硅（SiO2）基质中［7］，获得新型多功能纳米药物载体。本研究以紫杉醇作为药物模型，利用SiO2纳米实心球蚀刻中空介孔SiO2，并加入铕（Eu）元素，以构建SiO2纳米粒子载药平台，并观察其特性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料 硝酸铕六水合物［Eu（NO3）3·6H2O］、醋酸钠、无水乙醇、氨水、1-乙基-碳酰二亚胺盐酸盐［1Ethyl3（3dimethyllaminopropyl）carbodiie hydrochlide， EDC］、N-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxy succinimide， NHS），均购于阿拉丁生化科技有限公司；正硅酸四乙酯（tetra-ethyl orthosilicate， TEOS）、透明质酸（hyaluronic acid， HA）、纯度98% 紫杉醇（paclitaxel， PTX）、3-氨丙基三乙氧基硅烷［（3-aminopropyl）triethoxysilane， APTES］，均购于上海麦克林生化有限公司；1640 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS），均购于Gibco；SW1990 细胞，购于上海弘顺生物科技有限公司。高分辨率透射电子显微镜（FEI Talos F200S），ASAP-2460 自动表面积与孔隙率分析仪，岛津UV-2450 分光光度计，日立7000荧光分光光度仪，RF-5301PC 傅立叶变换红外分光光度计。

1.2 合成SiO2纳米实心球 将50 ml乙醇溶液、1.5 ml去离子水及2.5 ml 氨水混合均匀并加热至65℃，向其内逐滴加入1.9 ml 原硅酸四乙酯，于磁力搅拌器辅助下进行反应，设置转速400 r/min、反应时间5 h，再以10 000 r/min 离心；对所获固体以无水乙醇/去离子水交替洗涤3 次，再将其分散至去离子水中，制得40 mg/ml SiO2纳米实心球溶液，以电子显微镜观察其形态。

1.3 合成氨基修饰空心微球 将1 mmol Eu（NO3）3·6H2O 和5 mmol 醋酸钠溶于18 ml 去离子水中，加入2 ml SiO2纳米实心球溶液；将混合液转移至不锈钢反应釜的聚四氟乙烯内衬中，置于150℃烘箱中，水热反应12 h 后取出冷却至室温，8 000 r/min 离心，获得掺杂Eu 的中空介孔SiO2的样品Eu-hMSNs，并以电子显微镜观察其形态。向含1 ml APTES的乙醇溶液中（50 ml）加入Eu-hMSNs（50 mg），避光反应24 h，得到氨基修饰的空心微球Eu-hMSNs。

1.4 靶向物质HA修饰 将40 mg EDC和40 mg NHS溶于15 ml 超纯水中，加入10 mg HA，于室温下搅拌3 h 后，缓慢滴加5 ml NH2-Eu-hMSNs 溶液（4 mg/ml），于37℃、磁力搅拌器辅助下避光反应（200 r/min）12 h；对所得固体以去离子水洗涤3 次后冻干，得到HA修饰的空心微球HA-Eu-hMSNs，以电子显微镜观察其形态。

1.5 负载PTX 将40 mg HA-Eu-hMSNs 和40 mg PTX 溶于40 ml 无水乙醇中，利用超声混匀后于室温下搅拌（200 r/min）12 h 后，以8 000 r/min 离心，对所得固体以无水乙醇多次洗涤，直至上清液不再出现PTX 紫外吸收峰，得到HA-Eu-hMSNs-PTX；同时收集无水乙醇，以紫外分光光度计检测240 nm 处吸光度，并以标注曲线计算其PTX 含量及载药量，见公式（1）。

1.6 细胞培养 于37℃、5% CO2细胞孵箱中培养SW1990 细胞，以RPMI1640 培养基加10%胎牛血清及1%青链霉素混合液为培养液，每2 天更换1 次；待细胞增殖融合至80% 时，通过胰酶消化进行传代培养。

1.7 表征 以电子显微镜观察SiO2、Eu-hMSNs 和HA-Eu-hMSNs 形态结构，以表面积和孔隙率分析仪获得77K 下Eu-hMSN 氮气吸附-脱附等温曲线，利用分光光度计和荧光分光光度仪获得紫外、荧光和红外光谱。

1.8 细胞摄取 以胰酶消化对数生长期SW1990 细胞后，将1 ml 细胞悬液（细胞数1×105/ml）接种于6 个激光共聚焦显微皿中，置于细胞孵箱中孵育24 h 并均分为2 组，分别加入Eu-hMSNs-HA 和Eu-hMSNs，继续孵育24 h 后去掉培养液，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline， PBS）清洗3 次后，以4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色10 min，再以PBS 清洗3 次；最后加入1 ml无血清培养基，采用激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光信号强度。

1.9 HA-Eu-hMSNs 生物安全性 按照8 000 个/孔将SW1990 细胞接种于96 孔板中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h 后，分组（n=3）后分别加入不同浓度（5、25、50、100、200 μg/ml）HA-Eu-hMSNs 并继续培养24 h；采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8， CCK-8）检测各孔450 nm 处光密度（optical density， OD）并依据公式（2）计算细胞存活率，观察HA-Eu-hMSNs 生物安全性。

1.10 抑制增殖 选择处于对数生长期的SW1990 细胞，以PBS 洗涤、胰酶消化，按8 000 个/孔接种于96 孔板中，于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，分组（n=3）后分别加入游离PTX、含HA-Eu-hMSNs-PTX的纳米粒子悬液及含Eu-hMSNs-PTX 的纳米粒子悬液（悬液PTX 浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml）并孵育24 h；采用CCK-8 测量每孔450 nm 处的OD，计算细胞存活率，评估HA-Eu-hMSNs-PTX 抑制细胞增殖效果。

1.11 统计学分析 采用 SPSS 26.0 统计学分析软件。以±s表示计量资料，采用单因素方差分析行多组间比较，以LSD-t法行两两比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 表征特性 SiO2实心球直径（48.93±6.84）nm，Eu-hMSNs 直径和壳厚分别为（53.62±9.83）nm 和（8.62±3.14）nm，HA-Eu-hMSNs 直径为（61.33±8.94）nm。根据氮气吸附-脱附等温曲线（图1），EuhMSNs 表面积和总孔体积分别为134.48 m2/g 和0.31 cm3/g。Eu-hMSNs 中，Eu 被成功整合至介孔硅中（图2A），且于波长615 nm 处可见荧光特征峰（图2B）。

图1 Eu-hMSNs 氮气吸附-脱附等温曲线

图2 Eu-hMSNs X 线能谱图（A）和荧光光谱图（B）图3 Eu-hMSNs、Eu-hMSNs-NH2 及HA-Eu-hMSNs 的傅里叶红外光谱图图4 PTX、HA-Eu-hMSNs及HA-Eu-hMSNs-PTX 的紫外光谱图

光谱显示Eu-hMSNs、Eu-hMSNs-NH2及HAEu-hMSNs 在460 cm－1处和1 080 cm－1处出现吸收带；2 925 cm－1处可见一额外特征峰，提示APTES 成功附着于Eu-hMSNs；接枝HA 后，1 620 cm－1处出现一个新的吸附峰；见图3。紫外光谱中，HA-Eu-hMSNs 未见特征性吸收，而HA-Eu-hMSNs-PTX 于240 nm 处见明显PTX吸收带，据此确定PTX负载量为52.33 µg/mg。见图4。

2.2 细胞摄取 加入Eu-hMSNs 和HA-Eu-hMSNs后，SW1990 细胞的细胞核均被DAPI 染为蓝色并均可见红色荧光信号，但加入Eu-hMSNs 的信号较弱。见图5。

2.3 生物安全性 加入HA-Eu-hMSNs 24 h 后，加入最高浓度（200 μg/ml）组SW1990 细胞存活率仍在90%以上。见图6。

图6 HA-Eu-hMSNs 浓度影响SW1990 细胞存活率柱状图

2.4 抑制增殖 对于SW1990 细胞，PTX、EuhMSNs-PTX 和HA-Eu-hMSNs-PTX 均具有浓度依赖性细胞毒性。不同浓度间细胞存活率两两比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。PTX 浓度为1.0、5.0、10.0 μg/ml 时，PTX、Eu-hMSNs-PTX 与HAEu-hMSNs-PTX 的细胞存活率差异均有统计学意义（F=4.524、13.838、8.144，P=0.030、0.006、0.020），HA-Eu-hMSNs-PTX 的细胞存活率低于游离PTX 和Eu-hMSNs-PTX（P均＜0.05）。见图7。

图7 PTX 浓度和纳米药物对于SW1990 细胞存活率的影响的柱状图

3 讨论

临床对胰腺癌常采用化疗。PTX 为常用化疗药物之一，通过诱导细胞凋亡而阻断肿瘤细胞增殖，广泛用于治疗胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌等［8-10］，但水溶性较差、生物利用率较低。研发能在提高疗效的同时最大程度降低不良反应的智能载药纳米载体有助于提高化疗药物的生物利用率。现有可用纳米载体中，中空介孔SiO2的表面积较大、载药能力较佳，且其孔结构有序，易于表面功能化，生物相容性亦好。作为靶向物质，HA 可特异性与CD44 阳性肿瘤细胞结合。Eu 则能为纳米载体可视化提供基础。

本研究基于此成功制备了HA-Eu-hMSNs。制备过程中，Eu-hMNS 氮气吸附-脱附等温曲线上可见磁滞回线，表明其为中空介孔结构［11］；而在615 nm 处的荧光特征峰对应Eu3+的5D0→7F0跃迁［12］，表明所构建载药平台具备荧光效应，可作为示踪剂。细胞摄取结果显示，加入HA-Eu-hMSNs 后，SW1990 细胞的红色荧光信号强度高于加入Eu-hMSNs，提示HA 修饰可提高纳米粒子富集于SW1990 细胞的能力；安全性分析结果显示，HA-Eu-hMSNs 的生物安全性良好；抑制增殖测试结果显示，HA-Eu-hMSNs-PTX 的细胞毒性高于游离PTX 和Eu-hMSNs-PTX，原因可能在于HA-Eu-hMSNs-PTX 可利用CD44 受体介导的内吞作用提高细胞摄取效率，具备主动靶向性特征［13］。

综上所述，本研究成功制备的HA-Eu-hMSNs-PTX 粒径均匀、生物安全性佳，且具备良好的靶向能力和肿瘤细胞杀伤能力。