脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p水平与术后复发的相关性分析

马强 杨震 程浩 郑璐

安徽医科大学第二附属医院，安徽 合肥 230000

脑胶质瘤是一种恶性程度高且预后差的中枢神经系统原发性肿瘤［1］。脑胶质瘤的标准治疗方法是手术切除联合放化疗［2］。但由于胶质瘤浸润性生长的特点，肿瘤组织大多不能通过手术完全切除，术后复发率和病死率很高，患者的中位生存期较短［3］。因此，寻找预测脑胶质瘤患者术后复发的生物标志物具有重要意义。微小RNAs（miRNAs）能够与相应信使RNAs（mRNAs）的3’非翻译区（3’UTR）结合，最终导致转录后抑制或靶基因的降解或沉默［4］。研究发现，约30%的人类基因可以被miRNAs 调控［5］。此外单个miRNA可以与十几种mRNAs相互作用，最终同时影响许多基因的表达［6］。miRNAs的复杂调控功能通过影响细胞增殖、分化、侵袭、迁移和凋亡等多种生物学过程进而参与了一系列疾病的发生发展［7-8］。2002年首次发现与miRNAs相关的癌症［9］。此后，越来越多的研究表明miRNAs 在多种恶性肿瘤中异常表达并参与了肿瘤发生发展的调控［10-14］。BAO等［15］报道miR-27b-3p通过靶向RUNX1及Hippo信号通路抑制了胃癌细胞的迁移、侵袭及上皮间质转换。CHEN 等［16］报道miR-27b-3p 通过靶向LIMK1 抑制了结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭。在胶质瘤中，miR-27b-3p也被报道发挥着抑癌作用［17］。然而，目前尚无研究报道脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p水平与术后复发的相关性，本研究分析了脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p在术后复发中的预测价值，旨在为脑胶质瘤患者术后复发的风险评估提供新的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取安徽医科大学第二附属医院及安徽省立医院于2020-01—2022-12 接受手术治疗的脑胶质瘤患者共65 例为研究对象，同期颅脑损伤患者25例纳入对照组。脑胶质瘤组中男39例，女26例；年龄44～67（55.57±7.86）岁；肿瘤部位额叶32例，颞叶16 例，其他17 例；肿瘤直径≥4.5 cm 共27例，肿瘤直径＜4.5 cm 共38 例；WHO 分级Ⅰ～Ⅱ级26 例，WHO 分级Ⅲ～Ⅳ级39 例；手术完全切除22例，手术部分切除43 例。颅脑损伤患者男15 例，女10例；年龄45～69（56.08±8.09）岁。2组基本资料无显著差异（P＞0.05）。本研究内容经医院伦理委员会批准通过，患者或家属均签署知情同意。

1.2 脑胶质瘤组病例选择标准纳入标准：（1）患者符合脑胶质瘤的诊断标准［18］，且经病理及CT检查确诊；（2）首次确诊，且术前未接受任何其他治疗；（3）患者接受手术治疗。排除标准：（1）合并其他脑部疾病者；（2）合并重要器官功能障碍者；（3）合并精神类疾病者；（4）合并其他类型恶性肿瘤；（5）患者依从性差；（6）妊娠期或哺乳期女性。

1.3 检测方法手术完成2周后收集脑胶质瘤患者空腹静脉血5 mL，离心后取上层血清备用。采用血清RNA提取试剂盒提取血清总RNA，逆转录获得cDNA，采用实时定量逆转录聚合酶联式反应进行扩增，测定血清miR-27b-3p 水平。反应条件为96 ℃3 min；95 ℃30 s；59 ℃30 s；72 ℃40 s；71 ℃5 min，共进行39个循环。分析Ct值，采用2-ΔΔCT法计算miR-27b-3p水平。miR-27b-3p 及内参基因U6 的引物序列如下：miR-27b-3p正向引物：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA GTTGAGGCAGAACT-3’，miR-27b-3p 反向引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAG-3’。U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6 反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 复发随访术后随访6 个月，患者复查MRI 显示肿瘤生长范围较术前扩大或肿瘤出现在不同部位时为复发。

1.5 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0 进行数据分析，正态分布的计量数据以平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；分类数据以例表示，组间比较采用卡方检验；采用Cox回归分析探讨脑胶质瘤患者术后复发的危险因素；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线评估血清miR-27b-3p 水平对患者术后复发的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者血清miR-27b-3p表达水平比较脑胶质瘤组患者血清miR-27b-3p表达水平（4.57±1.38）显著低于颅脑损伤组（9.46±1.97），差异有统计学意义（t=11.370，P＜0.001）。

2.2 脑胶质瘤患者术后复发影响因素的单因素分析根据患者术后6个月的随访结果，将患者分为复发组（n=17）及未复发组（n=48），比较2 组患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、WHO 分级、手术切除程度及血清miR-27b-3p 水平。经分析发现2 组患者年龄、性别及肿瘤位置无统计学差异（P＞0.05）；2 组患者在肿瘤直径、WHO 分级、手术切除程度及血清miR-27b-3p 水平方面存在统计学差异（P＜0.05）；肿瘤直径≥4.5 cm、WHO 分级Ⅲ～Ⅳ级、手术未完全切除及低水平的miR-27b-3p 患者较肿瘤直径＜4.5 cm、WHO 分级Ⅰ～Ⅱ级、手术完全切除及高水平的miR-27b-3p患者更易复发。见表1。

表1 脑胶质瘤患者术后复发影响因素的单因素分析Table 1 Univariate analysis of factors influencing postoperative recurrence in glioma patients

2.3 脑胶质瘤患者术后复发影响因素的多因素Cox回归分析以患者术后6个月的复发情况（未复发赋值为0，复发赋值为1）为因变量，以肿瘤直径（＜4.5 cm赋值为0，≥4.5 cm赋值为1）、WHO分级（Ⅰ～Ⅱ级赋值为0，Ⅲ～Ⅳ级赋值为1）、手术是否完全切除（是赋值为0，否赋值为1）及miR-27b-3p 水平（高表达赋值为0，低表达赋值为1）为自变量进行多因素Cox回归分析。经分析发现肿瘤直径≥4.5 cm、WHO分级Ⅲ～Ⅳ级、手术未完全切除及miR-27b-3p低表达是脑胶质瘤患者术后复发的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 脑胶质瘤患者术后复发影响因素的多因素Cox回归分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of factors influencing postoperative recurrence in glioma patients

2.4 脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p 水平与临床病理特征的关系探讨本研究进一步分析了脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p水平与肿瘤直径、WHO分级及手术是否完全切除的关系，结果显示肿瘤直径≥4.5 cm及WHO 分级Ⅲ～Ⅳ级患者血清miR-27b-3p 水平显著低于肿瘤直径＜4.5 cm及WHO分级Ⅰ～Ⅱ级的患者（P＜0.05）。见表3。

表3 脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p水平与临床病理特征的关系Table 3 Relationship between serum miR-27b-3p level and clinicopathological features in glioma patients

2.5 血清miR-27b-3p 表达预测脑胶质瘤患者术后复发的价值分析采用ROC 曲线分析了血清miR-27b-3p水平对脑胶质瘤患者术后复发的预测价值，结果显示血清miR-27b-3p 预测脑胶质瘤患者最佳截断值为4.738，灵敏度66.67%，特异性94.12%，术后复发的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.826（95%CI=0.7263～0.9257，P＜0.001）。当血清miR-27b-3p水平低于4.738时，脑胶质瘤患者术后复发的风险增加。见图1。

图1 血清miR-27b-3p表达预测脑胶质瘤患者术后复发的价值分析Figure 1 Value analysis of serum miR-27b-3p expression in predicting postoperative recurrence in patients with glioma

3 讨论

胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤，由于其浸润生长的特点及肿瘤生长位置的限制，手术完全切除极为困难，因此患者术后复发及转移率较高［19-20］。患者的预后通常是基于侵入性手术活检得到的组织病理学和分子信息。然而，临床上脑胶质瘤的多次重复活检是不可行的。此外由于肿瘤的异质性，活检也会出现抽样误差［21］。循环生物标志物具有微创性、易获取及高重复性等优势，已被广泛用于各种疾病的诊断及预后评估［22-24］。miRNAs是一类长度为18～25个核苷酸的小非编码RNAs，其可在转录后水平调控基因表达［25-26］。miRNAs已被证明在多种恶性肿瘤中发挥重要作用，参与调节肿瘤生长、血管生成及免疫入侵等多种生物学过程。此外，miRNAs能够穿过血脑屏障并稳定存在于外周血，这一特点使其成为脑癌的理想生物标志物［27-28］。

目前，已有许多miRNAs被报道与脑胶质瘤的发生发展密切相关。GU 等［29］报道miR-218-5p 通过靶向TCF12 抑制了胶质瘤的恶性进展。CHEN 等［30］报道miR-376a-3p 通过负调控KLF15 抑制了胶质瘤的进展。miR-27b-3p也被报道作为抑癌因子参与了胶质瘤的发生发展过程。MIAO 等［17］报道miR-27b-3p通过靶向YAP1抑制了胶质瘤进展。ZHANG等［31］报道长链非编码RNA LINC 01128通过靶向miR-27b-3p促进了胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，表明了miR-27b-3p 在胶质瘤中的抑癌角色。然而，目前尚无研究报道血清miR-27b-3p水平与脑胶质瘤患者术后复发的关系。

本研究显示脑胶质瘤组患者血清miR-27b-3p表达水平显著低于颅脑损伤组，这一结果提示血清miR-27b-3p 在胶质瘤患者中失调，且其可能参与了胶质瘤的发生发展。分析发现2组患者年龄、性别及肿瘤位置无统计学差异，而在肿瘤直径、WHO分期、手术切除程度及血清miR-27b-3p水平方面存在统计学差异。多因素Cox回归分析发现肿瘤直径≥4.5 cm、WHO分级Ⅲ～Ⅳ级、手术未完全切除及miR-27b-3p 低表达是脑胶质瘤患者术后复发的独立危险因素。究其原因，肿瘤直径是肿瘤细胞数量最直接的体现，较大的肿瘤在密闭的颅腔内压迫脑组织的可能性更高［32］，因此肿瘤直径大的患者往往预后较差。WHO分级晚的患者提示其肿瘤恶性程度较高，因此术后患者的复发及转移率也相对较高。手术未能完全切除肿瘤的患者术后容易在肿瘤原发部位复发，且肿瘤的残余量是患者术后复发的影响因素之一。然而在临床上，虽然接受全切手术的患者可能延缓了肿瘤的复发，但手术过程本身有可能对患者脑重要功能区造成损伤，进而对患者术后生活质量造成不良影响。因此，临床上应尽量兼顾肿瘤的切除及患者脑神经功能区的保护［33］，以期在降低术后复发率的同时提高患者生活质量。

为探究miR-27b-3p影响脑胶质瘤患者术后复发的分子机制，我们分析了脑胶质瘤患者血清miR-27b-3p 水平与肿瘤直径、WHO 分级及手术是否完全切除的关系，结果表明血清miR-27b-3p 低表达与较大的肿瘤直径及较高的WHO分级显著相关，这一结果提示miR-27b-3p可能通过调节脑胶质瘤进展及转移影响患者预后。

ROC曲线分析结果显示血清miR-27b-3p预测脑胶质瘤患者术后复发的AUC 为0.826，表明血清miR-27b-3p水平对胶质瘤患者术后复发具有较高的预测价值。当血清miR-27b-3p水平低于4.738时，脑胶质瘤患者术后复发的风险增加。

本研究存在一定的不足。首先，本研究纳入的样本量较少，且未能统计脑胶质瘤患者术后的生存率，结果可能存在一定的偏倚。此外，miR-27b-3p影响胶质瘤进展机制缺乏深入的研究，未来将探索miR-27b-3p下游的靶基因以进一步揭示其在脑胶质瘤进展中的作用机制。

脑胶质瘤组患者血清miR-27b-3p表达水平显著低于颅脑损伤组。肿瘤直径≥4.5 cm、WHO 分级Ⅲ～Ⅳ、手术未完全切除及miR-27b-3p 低表达是脑胶质瘤患者术后复发的独立危险因素。血清miR-27b-3p水平对脑胶质瘤患者术后复发具有较高的预测价值。血清低水平的miR-27b-3p与较大的肿瘤直径及较晚的肿瘤分期显著相关，其可能通过影响胶质瘤的进展与转移影响患者术后复发。