线粒体参与铁死亡的研究进展*

刘 利 综述,杜 旅,张 平,邹 伟 审校

(南华大学衡阳医学院附属南华医院神经内科,湖南 衡阳 421002)

铁死亡的发生通常伴随着细胞内铁和亚铁离子的积累、脂质活性氧(ROS)生成、抗氧化系统的破坏及其他代谢变化。目前,已知细胞中至少有4种防御系统抵抗铁死亡,包括早期发现的主要铁死亡抑制通路——溶质载体家族 7成员11-谷胱甘肽-谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)[1],随后发现另外2条平行途径——泛醌-铁死亡抑制蛋白1[2]和三磷酸鸟苷环化水解酶1-四氢生物喋呤-二氢叶酸还原酶[3]也发挥着重要的抗铁死亡作用。此外还有由二氢乳清酸脱氢酶介导的独立于经典GPX4信号通路位于线粒体中的铁死亡防御系统[4]。铁死亡参与了神经退行性疾病、心血管疾病、炎症性疾病、癌症、缺血再灌注损伤等多种疾病的发生、发展。线粒体是细胞多种代谢活动的中心,现从线粒体的不同功能层面阐述线粒体对铁死亡的调控。

1 线粒体与铁死亡具有相关性

线粒体在细胞死亡调节中发挥着重要作用,已明确线粒体在细胞凋亡[5-6]、坏死性凋亡[7]、细胞焦亡[8]中均发挥着重要作用,但线粒体究竟是否直接参与铁死亡这一问题仍存在争议。胱氨酸/谷胱甘肽/GPX4系统是哺乳动物中抵御铁死亡的主要系统,2014年FRIEDMANN等[9]发现,GPX4失活在许多细胞系中诱导高程度的脂质过氧化,但在相同条件下通常不会诱导强烈的线粒体脂质过氧化,表明GPX4失活引起的铁死亡主要是由非线粒体脂质过氧化所致。有研究表明,在线粒体缺失的细胞系中用不同铁死亡诱导剂均可引发铁死亡,意味着线粒体可能并非是铁死亡发生过程所必须的[10]。然而近年来多项研究表明,线粒体相关的多种代谢活动在铁死亡的发生中均起着重要作用[11-12]。

有学者在2012年最早提出铁死亡这一概念时就发现,发生铁死亡的细胞线粒体形态学特征性表现为透射电镜下细胞内线粒体体积缩小、线粒体膜密度增加和线粒体嵴减少或消失[13]。在首次提出铁死亡这一概念时便提示线粒体与铁死亡具有相关性。随后有研究发现,线粒体对铁死亡相关刺激表现出高度的敏感性,在铁死亡相关刺激后不久即出现线粒体碎片化和脂质过氧化,同时,氧化磷酸化和呼吸电子传递链(ETC)复合物的抑制加重了RSL3诱导的铁死亡[14],进一步说明线粒体参与了铁死亡的发生。在阿霉素(DOX)诱导的心肌病中DOX下调GPX4,并通过DOX-亚铁离子(Fe2+)复合物诱导线粒体过度脂质过氧化,导致线粒体依赖性铁死亡,最终引发心脏毒性[15]。另一项为线粒体与铁死亡紧密联系提供有力证据的研究发现,二氢乳清酸脱氢酶介导的位于线粒体中的铁死亡防御系统是肿瘤治疗新靶点,二氢乳清酸脱氢酶是定位于线粒体内膜的黄素依赖酶,其将电子传递给线粒体内膜中的泛醌,使其被还原成为二氢泛醌,进而抑制脂质过氧化,抵抗铁死亡的发生[4]。

2 线粒体三羧酸循环(TCA)及氧化磷酸化与铁死亡

细胞呼吸分为糖酵解、TCA和氧化磷酸化,糖酵解发生在细胞质中,TCA和氧化磷酸化分别在线粒体基质和线粒体内膜上进行。在有氧的情况下糖酵解产生的丙酮酸进入线粒体基质中,经氧化脱羧形成乙酰辅酶A进入TCA,并产生能量和还原性电子载体——还原型辅酶Ⅰ和FADH2。氧化磷酸化是指糖酵解和TCA产生的还原性电子载体所携带的电子在线粒体内膜上由5种复合物构成的ETC释放能量,在三磷酸腺苷(ATP)合成酶催化下二磷酸腺苷被磷酸化生成ATP。

线粒体的TCA及氧化磷酸化参与调控铁死亡。一项对乙酰氨基酚诱导肝细胞铁死亡的研究表明,铁死亡抑制剂——Fer-1增加了TCA代谢物的水平,表明TCA抑制相关的线粒体功能障碍引起能量生成受损可能驱动对乙酰氨基酚诱导的肝细胞铁死亡[16]。在神经退行性疾病中同样存在线粒体代谢相关的铁死亡。一项探究NADPH 氧化酶4调节阿尔茨海默病星形胶质细胞铁死亡机制的研究发现,NADPH氧化酶4升高通过减少线粒体ETC中的5种蛋白复合物抑制线粒体呼吸和ATP生成破坏线粒体代谢导致氧化应激,从而诱导脂质过氧化促进星形胶质细胞发生铁死亡[17]。提示线粒体TCA和氧化磷酸化似乎在铁死亡的发生中扮演着抑制的角色;与此相反,有研究发现,线粒体TCA和ETC促进了半胱氨酸缺乏(CDI)诱导的铁死亡,抑制线粒体TCA或ETC复合物Ⅰ～Ⅳ可减少脂质过氧化物积累和铁死亡,还提示线粒体抑癌基因延胡索酸酶突变的肾癌细胞对CDI诱导的铁坏死敏感性明显降低,但直接抑制GPX4导致的铁坏死并不需要线粒体的参与[18]。更进一步的研究发现,线粒体复合物Ⅲ抑制剂对小鼠肝癌HepA 1～6细胞的脂质过氧化和CDI引起的铁死亡具有明显的保护作用,而线粒体复合物Ⅰ抑制剂对其无明显保护作用,此外线粒体复合物Ⅲ抑制剂还能抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的铁死亡[19]。提示在构成线粒体ETC的几种复合物中线粒体复合物Ⅲ可能在铁死亡中发挥着更为重要的作用。此外有研究发现,与低分化肝癌细胞株HA22T/VGH比较,高分化肝癌细胞株HepG2对RSL3诱导的铁死亡更敏感,且HepG2表现出比HA22T/VGH更明显的氧化磷酸化,更高的呼吸链复合物[20],表明线粒体氧化磷酸化参与了肝癌铁死亡的发生。

尽管线粒体TCA与ETC在不同诱因引发的铁死亡中发挥相反效应,但更多的证据支持线粒体TCA与ETC的代谢活动促进铁死亡,其中TCA与多种回补反应可通过促进ROS、多不饱和脂肪酸、ATP的生成驱动铁死亡,且线粒体ETC对ATP的产生至关重要,在ATP充足的情况下腺苷酸活化蛋白激酶不能被有效激活,从而无法灭活乙酰辅酶A羧化酶,继而促进多不饱和脂肪酸的磷脂合成和后续铁死亡的发生。但由于参与TCA及ETC代谢活动的生物分子繁多,其在铁死亡中具体扮演何种角色、相互之间的联系及发挥作用的机制仍需未来进一步深入研究。

3 线粒体自噬与铁死亡

细胞自噬是真核生物在进化过程中高度保守、基于溶酶体的一种胞内降解途径,对维持细胞和生物体的稳态平衡具有重要作用[21]。损伤的线粒体被特异性的包裹进自噬体中并与溶酶体融合,从而完成线粒体的降解,维持细胞内环境的稳定,这个过程被称为线粒体自噬。目前,研究最广泛的是由PINK 诱导假定激酶1-Parkin 介导的选择性清除多余或受损线粒体的自噬调控通路[22]。

有研究表明,线粒体自噬参与了铁死亡的发生、发展,并扮演着正向促进角色,如WJ460理化合物靶向肌铁蛋白引发线粒体自噬和ROS积累,最终导致脂质过氧化和铁死亡[23]。此外砷通过线粒体ROS-自噬-溶酶体途径诱发胰腺功能障碍和铁死亡,其中砷对线粒体的损伤表现为线粒体膜电位降低、细胞色素C水平降低和线粒体ROS的产生[24]。在糖尿病相关并发症,如糖尿病视网膜病变中也涉及线粒体自噬和铁死亡[25]。一项对糖尿病性骨质疏松的研究发现,沉默线粒体铁蛋白(ftmt)通过ROS/PINK诱导假定激酶1/Parkin途径诱导线粒体自噬的发生,最终促进铁死亡,而过表达ftmt通过减少过量亚铁离子引起的氧化应激,抑制成骨细胞中铁死亡的发生[26]。

线粒体自噬具体如何影响铁死亡的发生、发展尚无确切定论,可能通过增加内质网压力影响铁死亡,但也有研究表明,线粒体自噬与铁死亡无明显关联。目前,对线粒体自噬与铁死亡之间的关系认识尚浅,而线粒体自噬功能与神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等多种临床疾病的发病机制密切相关,对线粒体自噬与铁死亡联系进一步研究以期发现关键调控因子,将对疾病治疗提供新的方向。

4 线粒体DNA(mtDNA)与铁死亡

线粒体拥有自身的遗传物质——mtDNA,能独立进行复制、转录和翻译。mtDNA的突变率高于核DNA,且缺乏修复能力。mtDNA功能受核DNA的影响,mtDNA基因与核DNA突变均可导致线粒体蛋白质合成受阻,引起细胞能量代谢障碍[27]。

mtDNA没有组蛋白保护,更容易受到线粒体产生的ROS攻击,导致mtDNA氧化损伤。在研究扎西他滨对胰腺癌的治疗作用中发现,扎西他滨通过mtDNA氧化损伤激活的环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素刺激基因通路诱导自噬引发胰腺导管癌细胞发生铁死亡[28]。DOX通过嵌入mtDNA在线粒体中积累,以mtDNA含量依赖的方式诱导心肌细胞发生铁死亡[29]。更为经典的mtDNA与铁死亡相关的证据为mtDNA缺失综合征(MDS)。MDS是由于维持mtDNA合成的核基因突变,mtDNA含量严重减少,导致多组织器官功能障碍的疾病。MDS发生铁死亡的病理为患者肝细胞mtDNA缺失导致线粒体功能障碍、腺嘌呤核苷三磷酸合成减少、ROS大量增加及谷胱甘肽耗竭,继而核受体共激活因子4(NCOA4)介导铁蛋白在溶酶体中降解,铁蛋白里的铁释放至细胞质中,引起脂质过氧化增加,最终导致肝细胞铁死亡[30]。

mtDNA氧化损伤、mtDNA缺失均破坏了mtDNA的完整性从而促使铁死亡的发生,因此,mtDNA的修复有助于抵抗铁死亡。目前,生物体内的损伤修复途径主要包括碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、双链断裂修复和跨损伤DNA合成。不同mtDNA修复方式发挥抵抗铁死亡效应的强弱值得进一步探讨。

5 线粒体ROS与铁死亡

ROS是一类含氧的化学反应物质,包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基、单线态氧等。线粒体是ROS产生的重要来源,而铁死亡常伴有脂质ROS的大量生成。

线粒体ROS与铁死亡的发生具有强关联性,RSL3介导了浓度依赖性的GPX4抑制、脂质过氧化、线粒体碎裂增强、线粒体膜电位丧失和线粒体呼吸减少,在RSL3诱导神经元HT22细胞和小鼠胚胎成纤维细胞铁死亡中通过线粒体靶向ROS清除剂拯救线粒体的完整性和功能具有抵御细胞铁死亡的作用[31]。在铁死亡诱导剂——erastin处理SK-Hep1 ρ+细胞中发现了线粒体ROS的大量积累,由此诱发的铁死亡可被线粒体ROS猝灭剂抑制[32]。暴露于N-GQDs的小胶质细胞BV2线粒体中铁含量、ROS生成和脂质过氧化水平均增强,诱导线粒体氧化应激引起小胶质细胞铁死亡,而线粒体靶向ROS清除剂预处理提高线粒体抗氧化能力后可有效逆转上述改变[33]。

线粒体是ROS的重要来源,在多数情况下铁死亡的发生伴随ROS的生成,目前的研究说明线粒体中ROS的产生将促进铁死亡的发生,其具体机制可能是通过促进脂质过氧化,且可以被线粒体靶向的抗氧化剂或酶抑制。在发现线粒体ROS可诱导铁死亡前已发现线粒体ROS可诱导细胞凋亡,提示细胞凋亡与铁死亡之间可能存在分子联系,进一步寻找建立二者联系的关键分子将为研发新型靶向药注入新活力。

6 线粒体铁代谢与铁死亡

细胞内铁代谢受多种机制的精确调控,线粒体是细胞内最大的铁代谢细胞器,细胞质内游离铁通过ftmt转运进入线粒体,主要负责血红素和铁硫簇的生物合成[34]或储存在ftmt中。铁死亡的发生与体内铁含量增加相关,线粒体铁代谢异常对铁死亡的发生具有重要影响[35]。

线粒体中游离铁的过多积累可引发铁死亡。在脂多糖诱导的心脏损伤中脂多糖增加NCOA4的表达和细胞内Fe2+水平,NCOA4可直接与铁蛋白相互作用,以铁自噬的方式降解铁蛋白,释放大量的铁,细胞质Fe2+进一步激活线粒体膜上的铁硫霉素的表达,从而将细胞质Fe2+转运至线粒体,最终导致铁死亡[36]。此外百草枯通过NCOA4诱导的铁自噬途径引起细胞质和线粒体中铁的明显积累,铁超载引起脂质ROS产生诱导铁死亡[37]。CDGSH 铁硫结构域1是一种含铁的线粒体外膜蛋白,其抗铁死亡活性与线粒体铁积累有关,抑制CDGSH铁硫结构域1表达增加线粒体铁积累和脂质过氧化可引发铁死亡[38]。Ftmt在铁稳态中具有重要作用,在小鼠缺血脑组织中ftmt水平上调,缺乏ftmt的小鼠发生更严重的脑损伤和神经功能缺损,并伴有铁死亡的分子特征,包括脑缺血再灌注损伤后脂质过氧化增加和谷胱甘肽紊乱[39]。

在线粒体中铁自噬促进游离铁的释放从而驱动脂质过氧化最终发生铁死亡,调控线粒体Fe2+转运相关蛋白的活性及铁自噬相关铁蛋白的水平进而改变线粒体中游离铁的丰度,将影响铁死亡的发生。

7 线粒体其他功能与铁死亡

线粒体是一种处于高度运动状态的细胞器,频繁地出现分裂和融合,其中线粒体融合包含2个步骤,即由线粒体融合蛋白介导的外膜融合和由视神经萎缩蛋白1介导的内膜融合[40]。据文献报道,线粒体融合也参与了铁死亡,经典的铁死亡诱导剂——erastin会诱导干扰素基因刺激蛋白1在线粒体中积累,在线粒体中与线粒体融合蛋白1/2结合,触发线粒体融合,导致后续ROS的产生和脂质过氧化,促进人胰腺癌细胞系的铁死亡[41]。钙信号传导在细胞周期调控中具有重要作用,线粒体是细胞内钙的储存细胞器之一[42]。低温下线粒体钙离子增加、线粒体膜电位超极化需要线粒体钙离子摄取调节剂——线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1),全基因组CRISPR 筛选发现,MICU1是在冷应激下产生脂质过氧化物和引发铁死亡所必需的,小干扰RNA敲除MICU1可抑制冷应激诱导的肾和肝来源细胞系发生铁死亡[43]。线粒体中还存在多种酶对铁死亡具有调节作用,如线粒体外膜蛋白——FUN14 结构域蛋白2通过降低谷胱甘肽转运蛋白——溶质载体家族25成员11的稳定性和二聚体形成引起线粒体内谷胱甘肽含量下降,继而线粒体发生氧化损伤和形态功能异常,导致脂质过氧化和铁死亡,这也是DOX诱导心肌病的分子机制之一[44]。此外还有定位在线粒体内膜上的酶——甘油-3-磷酸脱氢酶2,通过在线粒体内膜还原泛醌为泛醇抑制线粒体脂质过氧化,从而抵御细胞铁死亡[45]。

8 小 结

线粒体在铁死亡中的作用一直存在争议,但近年来越来越多的研究说明线粒体与铁死亡的发生关系密切。基于线粒体参与调控多种代谢活动,且线粒体不同功能在参与铁死亡发生、发展的过程中并非孤立,而是相互关联。因此,线粒体中多种代谢的联合作用如何影响铁死亡及具体机制值得继续探讨。2022年3月TSVETKOV等[46]发现了一种全新的细胞死亡方式——铜死亡,铜离子通过直接结合TCA途径中的脂酰化成分导致脂酰化蛋白异常聚集及铁硫簇蛋白的丢失,从而导致蛋白质毒性应激反应最终导致细胞死亡,铜死亡通过将铜靶向线粒体触发细胞死亡。由此可见,线粒体不仅在铁死亡的发生中发挥作用,还可能参与了铜死亡的发生,而线粒体在各种细胞死亡中扮演何种角色尚不明晰,对线粒体与铁死亡及其与他细胞死亡方式关系的探索,将有助于充分认识不同细胞死亡方式之间如何相互联系并为临床疾病的治疗提供新思路。