超高效液相色谱–四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速检测三七农药残留

王 英，李云飞，陈庚超，朗帕实，袁梓程，高 燕，彭 云，吴思超*

（1.昆明海关技术中心,云南 昆明 650208；2.黄埔海关技术中心,广东 东莞 523071）

三七作为一种重要的药用植物资源和保健食品[1]，具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、止血活血等药理作用[2-7]。由于三七在生长过程中，极易遭受各种病虫的侵害，因此在种植过程中难免会使用农药，药农过量使用农药防治三七的病虫害，导致三七中的农药残留超标[8-9]，不仅对人类健康造成威胁还造成严重的环境污染。由于农药残留超标导致我国出口中药被封存、销毁或者退货的情形[10-11]时有发生，因此建立三七中农药多残留的快速筛查方法十分必要。

三七在种植过程中使用的农药主要包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂、生长调节剂等，按照化学结构可以分为有机氯、有机磷、拟除虫菊醋和氨基甲酸酯等类型[8]。目前农药残留前处理净化方法主要包括凝胶渗透色谱法(GPC)[12]、固相萃取法(SPE)[13]以及QuEChERS 法[14]。检测技术上主要采用气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法、高分辨质谱法等[15-18]。随着农药种类的不断增加，亟须发展高通量、快速有效的同时筛查多类农药残留的检测方法[19]，四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法具有选择性高、灵敏度高、扫描速度快等优点，在没有标准物质的情况下通过全扫描数据实现定性确证[20]，适用于多种目标化合物的筛查和确证分析[21]。

本实验采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱建立了三七中66 种农药残留的快速筛查检测方法，较普通液相色谱-串联质谱具有更高的分辨率，该方法前处理简单、快捷、实用性强，可为保障三七安全性评估提供参考，同时也可为解决中药中多种农药残留检测问题、保障中药质量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三七药材购于云南鸿翔一心堂药业（集团）股份有限公司；66 种农药液体混合对照品溶液（具体种类详见表1）购自上海安谱实验科技股份有限公司，质量浓度为50 mg/L；甲醇（色谱纯）购自美国Sigma 公司；乙腈（色谱纯）购自美国Sigma 公司；甲酸铵、冰乙酸（色谱纯）购自上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸（分析纯）购自西陇科学股份有限公司；无水MgSO4和NaCl（分析纯）、石墨化碳黑氨基复合SPE 小柱均购自上海安谱实验科技股份有限公司；300 mgPSA+300 mg C18+900 mg 无水MgSO4+90 mgGCB，购自山东青云实验耗材有限公司。

表1 66 种农药的分子式、保留时间、相对质量偏差、母离子和碎片离子Tab.1 Molecular formulas,retention times,relative mass deviations,precursor ions and fragment ions of the 66 pesticide residues

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000 Q-Exactive 超高效液相色谱－四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Orbitrap HRMS，美国Thermo Fisher 公司）；高速冷冻离心机（3-30K，德国Sigma 公司）；涡旋振荡器（HS501，德国IKA 公司）；分析天平（XPE105，德国Sigma 公司）；超纯水系统（电导率为18.2 MΩ，美国Millipore公司）；氮吹仪（TurboVap LV，瑞典Biotage 公司）；旋涡混合仪(瑞士Mettler Toledo)；凝胶色谱仪（GPC Ultra 10836，德国LC Tech 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准品的配置

精密量取上述66 种农药液体混合对照品溶液1 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配置为10 mg/L 的标准储备液，置于4 ℃冰箱避光保存；精密量取上述适量农药标准储备液0.5 mL置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配置为各目标化合物相应质量浓度（1.0 mg/L）的混合标准工作液。

1.3.2 数据库的构建

通过全扫描模式对1.0 mg/L 的农药混合标准工作液进行分析，得到66 种农药的一级离子流图，保留时间、母离子精确质量数等信息，同时采用ddMS2二级质谱扫描模式，获得目标化合物的二级质谱图和特征碎片离子[19]，利用Trace finder 软件对每种农药的保留时间，母离子、子离子精确质量数及二级特征碎片离子与各自目标化合物名称、化学式相关联进行数据库的构建（见表1）。

根据建立的数据库对三七样品中的农药残留进行定性筛查确证，依据保留时间、精确质量数偏差与数据库进行匹配，若获得2 个或2 个以上特征碎片离子匹配，质量数的偏差小于或等于5.00×10-6，保留时间偏差在±2.5%之内，可以判定试样中含有该种农药。以各目标化合物母离子作为定量离子，并采用基质标曲外标法定量[19]。

1.3.3 实验条件的优化

1.3.3.1 色谱条件的优化

由于66 种农药的理化性质各异，本实验分别比较了Accucore aQ 色谱柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)、Hypersil GOLD C18 色谱柱（100×2.1 mm，1.9 μm）、ACQUITY BEH C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)对目标化合物的分离效果，发现Accucore aQ 色谱柱对66 种农药有较好的分离效果。同时，比较了水相中添加不同浓度的甲酸、乙酸、甲酸铵，有机相为甲醇、乙腈的不同流动相的色谱分离效果，发现5 mmol/L 甲酸铵（含0.1%甲酸）+甲醇组合能够更好地分离目标化合物并能提供良好的色谱峰型，同时具有较高的响应强度，总离子色谱图见图1。

图1 Accucore aQ 色谱柱总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of Accucore aQ column

1.3.3.2 前处理方式的优化

本研究分别考察了GPC、石墨化碳黑氨基复合SPE 小柱和经典的QuEChERS 方法3 种前处理方法。以空白三七样品10 μg/kg 为加标浓度进行加标回收实验，其回收率结果如图2 所示。由图2可知，QuEChERS 方法有64 个化合物的加标回收率集中在70%～120%，优于其他两种前处理方法，因此本实验采用QuEChERS 方法进行前处理，该方法具有简便、快速、高效、灵敏度高等优势非常适合多类农药残留的检测前处理。

图2 66 种农药不同前处理回收率(10 μg/kg) (n=3)Fig.2 Recoveries of 66 kinds of pesticide residues under different pretreatments (10 μg/kg) (n=3)

1.3.4 三七样品的测定

1.3.4.1 样品前处理

采用QuECHERS 方法对三七样品进行前处理：精密称定三七样品粉末（过三号筛）3 g，加入1%冰乙酸溶液15 mL，涡旋放置30 min，精密加入乙腈15 mL，震荡提取5 min，加入无水MgSO4和NaCl（4 g+1 g），涡旋混匀之后4 200 r/min 离心5 min，取上清液10 mL 加入净化剂（300 mg PSA+300 mg C18+900 mg 无水MgSO4+90 mg GCB）涡旋混匀，震荡提取5 min 后，4 200 r/min 离心5 min，通过0.22 μm 有机相微孔滤膜，待测定。

1.3.4.2 色谱条件

色谱柱：Accucore aQ 色谱柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A为水相由5 mmol/L 甲酸铵（含0.1%甲酸）水溶液组成；B为有机相由甲醇溶液组成；梯度洗脱方式，具体系统程序详见表2。

表2 梯度洗脱表Tab.2 Gradient elution program

1.3.4.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；正离子Full MS-ddMS2扫描模式；喷雾电压：3 000 V；鞘气压力：40 arb；辅助气压力：10 arb；离子源温度：325 ℃；离子传输管温度：300 ℃；碰撞气：Medium；一级质谱扫描范围m/z 100～1 000；二级质谱扫描范围m/z 50～800；一级质谱全扫描分辨率70 000，二级分辨率为17 500。

2 结果与分析

2.1 基质效应考察

分别以空白三七样品经上述前处理方法后获得的基质溶液和甲醇为溶剂，分别配置质量浓度100 μg/L 的农药混标溶液，测定各目标化合物的峰面积响应值。基质效应计算公式[22]如下：

式中：A1为基质溶液中目标化合物响应值；A2为甲醇溶剂中目标化合物响应值。

当基质效应值大于100%时为基质增强效应，基质效应值小于100%时为基质抑制效应[23]。实验结果表明，27 种农药产生了不同程度基质抑制效应，为克服基质效应的影响，采用基质匹配外标法进行定量分析。

2.2 线性范围与定量限

采用空白三七样品经上述前处理方法制得空白基质溶液，配置成质量浓度分别为0、0.005、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L 的农药混合标准工作液，以母离子作为定量离子，以各目标化合物色谱峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x，μg/L)为横坐标绘制标准曲线。实验结果表明，66 种农药在0.005～0.5 mg/L 范围内呈良好线性关系，R2均大于0.99。用基质空白溶液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度确定为检出限(limit of detection，LOD)[24]，得到各目标化合物检出限(LOD)在0.005～0.01 mg/kg 范围内，可满足痕量分析检测要求，即样品中待测组分含量低于100 μg/g 的分析工作[25](见表3)。

表3 66 种农药线性范围、回归方程、相关系数和检出限Tab.3 The linear equation,correlation coefficient and LODs of 66 pesticide residues

2.3 回收率与精密度

为验证检测方法的准确度、精密度，向空白三七样品中分别添加质量浓度分别为10、50、100 μg/L 的66 种农残混合标准溶液，按照相同的前处理方法和仪器条件进行检测，各水平重复6 次。以测定结果的相对标准偏差考察方法的精密度，并计算不同浓度的加标回收率。由表4 可知，66 种农药平均回收率在71.7%～110.3%之间，相对标准偏差(RSD)在1.2%～6.8%之间，说明本方法回收率高，精密度高，可用于三七中多种农药残留的检测分析。

表4 66 种农药加标回收率及相对标准偏差（n=6）Tab.4 The piked recoveries and relative standard deviations of 66 pesticide residues

2.4 实际样品的测定

通过检测市售三七样品，进一步评估该方法在实际样品检测的实用性。将该方法应用于50 个三七样本进行非靶向筛查分析，将获得的三七样品的色谱信息和质谱信息与数据库进行搜索对比，确定所测三七样品中含有农药烯酰吗啉、恶霜灵、戊唑醇、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑。

利用基质匹配外标法，对待测三七样品中的烯酰吗啉、恶霜灵、戊唑醇、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑进行定量分析，得到待测三七样品中烯酰吗啉含量为0.058～2.45 mg/kg、恶霜灵含量为0.045～1.38 mg/kg、戊唑醇含量为0.44～2.30 mg/kg、甲基硫菌灵含量为0.072～0.86 mg/kg、苯醚甲环唑含量为0.065～5.40 mg/kg。

3 结论

本研究基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱，建立了三七中66 种农药残留的检测方法，该方法快捷简便、特异性好、灵敏度高、回收率好，可针对性地对农药残留进行快速筛查。在没有对照品的情况下，可与所建质谱数据库中一级、二级质谱的精确质量数和碎片离子信息等进行匹配，可以实现非目标化合物的定性筛查。该方法可为中药农药残留的快速筛查提供技术参考。