马铃薯抗寒性鉴定及筛选

舒启琼, 罗小波, 李 飞, 罗 充, 冯文豪, 陈明俊, 曹贞菊

(1.贵州省农科院生物技术研究所/国家马铃薯改良中心贵州分中心/贵州省马铃薯工程技术研究中心, 贵阳 550006;2. 贵州师范大学生命科学学院, 贵阳 550001; 3.贵州省农作物技术推广总站, 贵阳 550001)

低温对植物造成的伤害分为冷害(Chilling injury)和冻害(Freezing injury)。冷害是指0～10 ℃温度对植物造成的伤害,植物出现暂时的新陈代谢功能紊乱和活性氧等有毒物质的积累,但能够在环境适宜的情况下恢复。冻害则是指0 ℃以下低温对植物造成的伤害,冻害使植物体内的水形成冰晶,破坏细胞结构,同时造成细胞内容物浓度增高而引起有毒物质的积累,造成不可恢复的伤害[1]。在长期的自然选择中,植物为应对低温胁迫而进化出了非驯化抗寒能力(Non-acclinmated freezing tolerance,NFT)和驯化抗寒能力(Acclimation capacity,ACC)[2]。植物不经过低温驯化就具有抗低温霜冻能力称为NFT,经过一定周期冷驯化而具有的抗低温霜冻的能力称为ACC。在植物抵御低温胁迫的过程中,伴随着植物膜中的分子和生理修饰,胞浆Ca2+的积累,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的增加和ROS清除系统的激活,抗冷相关基因和转录因子表达的变化,蛋白质和糖合成的改变,脯氨酸的积累,以及影响光合作用的生化变化等[1,3]。

马铃薯(SolanumtuberosumL.)属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)一年生草本植物,明代传入中国,而后被广泛种植,是食用国家最多的作物,也是全球四大经济作物之一,营养丰富、适应性强和生育期短等优点使得马铃薯的需求量逐年增高,中国是世界当前马铃薯种植第一大国[5-6]。马铃薯富含蛋白质、维生素、矿物质和膳食纤维等,具有粮菜兼用和综合加工等广泛用途[4]。马铃薯是喜冷凉但不耐低温作物,中国马铃薯主产地北方一作区、中原二作区、西南混作区和南方冬作区几乎都会遭受低温霜冻灾害。2008年的冰雪灾害使得中国南方各地的马铃薯受灾面积达40.93万hm2,造成经济损失高达10亿元[7]。2016年江西鄱阳湖地区的寒潮天气导致当地马铃薯幼苗冻死率高达75%～95%,造成当地马铃薯严重减产[8]。2018年广西玉林市马铃薯因遭受低温冻害无法达到商品薯标准(100 g以上),造成严重经济损失[9]。低温霜冻制约马铃薯产业的发展,鉴定筛选较为抗寒的马铃薯材料,改良马铃薯耐冻性尤为重要。

植物抗寒性表型鉴定的方法有露地栽培鉴评法、寒冻灾害调查法、人工模拟低温法和数学建模预测法、电解质渗出率法等[10]。马铃薯抗寒性鉴定的方法主要有田间自然霜冻法、生理生化指标测定法、电解质渗漏法。电解质渗漏法结合Logistic方程以及隶属函数和聚类分析法被广泛应用于植物抗寒性鉴定,在马铃薯抗寒性鉴定中被认为是较为可靠的方法[10-12]。本研究采用电导率渗漏法对82份马铃薯材料进行抗寒性鉴定,评价并筛选较为抗寒的马铃薯材料,以期为贵州马铃薯生产、品种推广以及抗寒育种亲本的选择提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所选用的材料均来源于贵州省农业科学院马铃薯研究所,包括2份野生种、66份普通栽培种和14份后代品系。于2020年4月种植于贵州省农业科学院生物技术研究所大棚,大棚室温20～25 ℃。挑选薯型大小均匀(50 g左右)、健康无病薯块播种于10 cm×10 cm的塑料钵内(V泥炭土∶V蛭石=1∶1),每份材料播种7盆。出苗后生长40 d,取大小一致的功能叶片进行电导率测定。

1.2 实验方法

1.2.1低温处理及电导率测定

马铃薯抗寒性鉴定参照李飞[13]、邓高峰[14]的方法,略有改动。

实验仪器:取样袋、剪刀、冰盒、低温水浴锅、试管(25 cm×15 cm)、试管架、高压蒸汽灭菌锅、电导率仪、刀片、镊子、加样器等。

取样:实验设置5个温度点(0 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-6 ℃、-7 ℃),每个温度点设置3个重复。按照低温水浴锅的容量每次最宜处理15个材料,每个材料应选择大小、叶龄相似的功能叶片,每个材料可多取几片备用,不要剪伤叶片,取完后放入冰盒,快速进行下一步实验处理。

样品清洗:用蒸馏水将叶片清洗干净,后置于吸水纸上将水分吸干。

样品放置:用镊子轻轻将叶片置于试管底部,叶柄面朝下,使叶背面贴住试管壁,然后将试管依次放置于标记好处理温度的试管架。

低温处理:低温水浴锅液体媒介为蒸馏水和酒精,0 ℃的试管架直接置于冰上并放在4 ℃冰箱过夜,其余的都放置于低温水浴锅,待水浴锅显示温度降到0 ℃时开始计时,30 min后调节温度为-0.5 ℃再保持30 min,温度从-0.5 ℃降到-1 ℃并保持30 min后在每只试管中加入小块冰,再保持30 min后将温度降为-1.5 ℃,保持1 h,后降温至-2 ℃保持30 min,取样。依次按0.5 ℃/30 min速度降温,温度达到目标温度时,取样,尽快置于冰上,放入4 ℃冰箱中解冻过夜。

电导率测定:将完全解冻的样品用锋利的刀片切成5 mm的小条装入试管,同时加入25 mL蒸馏水。用真空泵以0.1 MPa的真空度抽气6 min,置于摇床中以220 r/min的速度振动1 h,静置后用电导率仪测定煮沸前电导率R1,然后将每个试管盖上盖子,放置于高压蒸汽灭菌锅中煮沸10 min,冷却至室温测煮沸后电导率R2。计算电解质渗出率。

电解质渗出率/%=(R1/R2)×100%。

1.2.2LT50值的计算

将每个温度点对应的电解质渗出率3次重复结果的平均值结合Logistic方程计算样品半致死温度(LT50)。

Logistic方程y=1/[1+eB(c-x)],式中:y、x分别表示相对电导率和处理温度;B、C分别表示方程拐点斜率和样品LT50值。

1.3 数据处理

数据统计分析及作图采用Excel2019软件,抗寒性Logistic回归模型建立采用DPS v7.5软件,聚类分析采用统计分析软件SPSS25.0。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫后马铃薯电导率变化情况

抗寒性差的马铃薯叶片在低温处理后变瘫软,叶片颜色逐渐变黑。以Cip43和云薯902号的离体叶片为对照(表1),经低温梯度处理后对应的电导率拟合Logistic方程为代表,使植物电导率达到50%时的低温处理温度即为该材料的半致死温度(LT50)。-4 ℃低温处理Cip43,电解质渗出率为33.78%,电解质渗出率还未达到50%,显现出较强的抗寒能力。云薯902号经低温处理到-2 ℃时,电解质渗出率为53.98%,说明其半致死温度大于-2 ℃,抗寒性较差。植物电解质渗出率结合Logistic方程拟合计算得出的半致死温度能较为准确地反映植物抗寒性。

表1 Cip43和云薯902号电解质渗出率

相对电导率随处理温度变化呈“S”型曲线变化,较直观地反映了植物抗寒能力[13]。Cip43与云薯902号在经低温处理后,相对电导率与处理温度呈“S”型曲线变化(图1),电导率达50%时,经Logistic方程拟合计算得出Cip43和云薯902号半致死温度分别为-4.6 ℃和-1.6 ℃。Cip43半致死温度比云薯902号低3 ℃,抵御低温胁迫的能力显著较强。

图1 低温处理Cip43和云薯902号离体叶片后电导率拟合Logistic回归方程曲线

2.2 马铃薯电导率Logistic回归方程及抗寒性鉴定

分别以Cip43和云薯902号作抗寒性对照,参照李华伟等[15]、魏亮等[16]的分析方法进行抗寒性鉴定。对82份马铃薯材料进行低温处理,测定电导率并进行Logistic线性回归分析,建立Logistic回归模型求出方程和LT50,而后进行抗寒性鉴定,结果见表2。LT50值与抗寒性呈负相关,LT50值越小则抗寒性越强。Cip43拟合方程为:y=106.653/[1+e(3.463-0.749x)],LT50值为-4.6 ℃,R2=0.974,拟合度达极显著水平。云薯902号拟合方程为y=78.296/[1+e(1.174-0.879x)],LT50值为-1.6 ℃,R2=0.986,达极显著水平。

表2 82份马铃薯材料电导率拟合Logistic回归方程及半致死温度

根据电导率与Logistic回归方程拟合求出的半致死温度(LT50)对82份马铃薯材料进行抗寒性鉴定。结果发现,82份材料的半致死温度为-4.8 ℃～-1.6 ℃,其中云薯902号、宣薯6号和Q5等11份马铃薯材料LT50>-2.5 ℃,占比13.41%,抗寒性最差;LT50在-4.0 ℃～-2.5 ℃之间的材料有64份,占比78.05%,抗寒性介于抗寒和霜冻敏感之间;Cip43、大同20和BF004等7份马铃薯材料LT50≤-4.0 ℃,占比8.53%,抗寒能力强,其中大同20抗寒性最强,半致死温度达-4.8 ℃(图2)。

图2 82份马铃薯材料抗寒性分布

2.3 82份马铃薯材料抗寒性聚类分析

根据表2对82份马铃薯材料抗寒性进行聚类分析(图3),在平均欧氏距离为18时,可将82份材料分为三类:第一类为抗寒能力较强的大同20、Cip43等7份材料,LT50值在-4.0 ℃～-4.8 ℃之间,平均值为-4.3 ℃,在82份抗寒性材料中属于强抗寒性品种;第二类材料抗寒性处于中间位置,LT50值在-4.4 ℃～-2.5 ℃之间,包括宣薯2号、中薯5号、东农310和费乌瑞它等64份材料;第三类材料属于低温敏感材料,半致死温度均高于-2.5 ℃,其中抗寒性最差的为云薯902、Q5和Cph12。

图3 82份马铃薯材料抗寒性聚类分析

3 结论与讨论

马铃薯作为世界第四大粮食作物,对促进地区经济发展、消除地区贫困以及保障粮食安全起着重要作用[17]。我国作为马铃薯生产第一大国,几乎每个种植区域都存在低温霜冻胁迫的风险。低温霜冻轻则影响马铃薯光合作用以及生理生化功能和块茎的形成,重则使得马铃薯萎蔫甚至死亡,导致减产造成严重经济损失。自然界中存在丰富的野生马铃薯抗寒资源,已经证实,S.commersonii、S.boliviense、S.demissum、S.chomatophilum等35个野生种中均存在抗寒株系[16-17]。目前广泛种植的马铃薯栽培种大部分不具抗寒性,将野生抗寒性资源应用于栽培种的选育,对推进马铃薯抗寒性育种进程具有重要意义。对现有栽培品种(系)及野生种进行抗寒性鉴定,筛选出优质抗寒材料,能够为后续利用常规杂交育种及分子技术育种提供种质资源及参考。

马铃薯抗寒性研究最常用的方法为田间自然霜冻法和电导率测定法,自然霜冻法最先由Vega和Bamberg[20],赵喜娟等[21]通过对田间自然霜冻后的马铃薯植株损伤程度进行评级来直观评价马铃薯抗寒性,依赖于田间自然霜冻天气,存在一定的限制因素;电导率测定法主要利用离体叶片在室内进行实验,能够打破自然环境的限制,其原理是通过测定离体叶片在不同低温胁迫下的电解质渗出率差异来反映叶片受伤程度和抗寒性强弱,当叶片电解质渗出率达到50%时的温度即为测定材料的半致死温度,电导率结合Logistic方程计算半致死温度反映植物耐寒性是当前最为可靠的抗寒性鉴定方法。

本实验通过对82份马铃薯材料进行电解质渗出率测定,并结合Logistic方程计算半致死温度,研究表明,马铃薯栽培种绝大多数抗寒性较差,与前人[15-16,22-23]研究结果一致。聚类分析可将82份马铃薯材料分为11份霜冻敏感型材料(抗寒能力最弱)、64份中间型材料和7份较强抗寒型材料。鉴定筛选出抗寒性最强的马铃薯材料为大同20和Cip43,可为后续马铃薯抗寒性研究及育种提供参考。